肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)_第1页
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)_第2页
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)肿瘤细胞侵袭实验(Tumour InvasionAssay)可以:(1)研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响;(2)一些抑制血管生成的新药研究;(3)研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。实验方法 Matrigel 基质膜模型实验方法原理Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖,铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上,能在DMEM培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8um,而且膜孔都被Matrigel覆盖,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,

2、并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜,这与体内情况较为相似。铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间,铺有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趋化剂,如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液,上室加入重悬的瘤细胞,具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关,选择 25ugMartrigell铺膜,16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面,可用棉签将上表面的细胞拭去,然后用乙醇固定滤膜,PE染色,在光镜下观察统计穿过Martri

3、gel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析,这一方法是在 Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel,加入细胞72h后观察结果。值得注意的是,细胞在TransWll腔中培养 72小时后,有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面,而是脱落进人下腔溶液中因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性,可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。在上述分析中,如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间,细胞通过变形运动穿过滤膜,用这种模

4、型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外,在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN,可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。实验材料Matrigel 基质胶试剂、试剂盒DMEM结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM培养基FBS-DMEM培养基IFN-仪器、耗材24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验步骤一、溶液配制1. DMEM(1)NE-A液(1 g/l,1 mg/ml)(2)母液0.1 ml(5 mg)+ ddH2O up to 5 ml ;过滤消毒,-20保存。2. NE-DMEM(-6 M)NE-A液(1 g/l,1 mg/ml

5、) 20.5 lDMEM UP TO 100 ml过滤消毒,4保存3. NE+CGRP-DMEM(-6 M,100 ng)(1)NE-A液(1 g/l,1 mg/ml) 20.5 l(2)CGRP-储存液 50 l(3)DMEM UP TO 100 ml(4)过滤消毒,4保存4. NE+IFN-DMEM(-6 M,50 ng)(1)NE-A液(1 g/l,1 mg/ml) 20.5 l(2)IFN-(25ng/l) 25 l(3)DMEM UP TO 100 ml(4)过滤消毒,4保存。5. 低血清DMEM培养基(上室)6. 20%FBS-DMEM培养基(下室)7. Matrigel 基质胶(

6、1)10 mg/ml,5 ml,分装成0.5 ml/只10个EP管中。(2)用时加入0.5 ml的DMEM。(3)Matrivgel在冰上维持液态,室温时可迅速凝结成胶。二 、 准备1. 溶胶,4过夜。2. 室温下基质胶易成凝胶,所以,步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。三、 包被基底膜(冰上操作)1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶。2. 取100 ul稀释胶加到24-well transwell上室中。3. 37孵育transwell至少4-5 h 。四、 水化基底膜1. 用无血清培养基轻洗凝胶 。五 、 准备细胞悬液和小室1. 消化法从细胞培养瓶中获取

7、细胞。2. 用培养基洗3遍。3. 重悬细胞,5105 cells/ml,1% FBS 。4. 上室加200 ul细胞悬液。5. 下室中加入600 ul细胞培养基,含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族。六 、 孵育37,20 to 24 h 。七 、 染色和计数1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。2. 移去transwells,倒置,风干。3. 24孔板中加入500 l含0.1%结晶紫,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37 30min后取出,PBS清洗。4. 直径上取4个视野,照相,计数。5. 24孔板中加入500 l 33%醋酸,将小室置于其中,浸膜,振荡10 min,充分溶解。取出小室,24孔板于酶标仪上570nm测OD值,间接反应细胞数。展开注意事项1. 照相前一定要晾干,照相时将小室正置于载玻片上,在倒置

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论