中药红外光谱鉴定关键技术研究

1、中药红外光谱鉴定关键技术研究,孙素琴（清华大学分析中心） 2008.04.14 ,“第五届中药提取技术（北京）研讨会, 2008.4.12-14,目 录,红外光谱法与中药鉴定需要解决的难题 红外光谱技术的发展 关键技术 理论基础：“红外宏观指纹法” 判别准则：三级评价标准和三级鉴定 应用举例：举例一 中药材（淫羊藿） 举例二 中药饮片(熟地黄) 举例三 中药配方颗粒（肉豆蔻和乳香） 举例四 油剂（正红花油） . 特点和优势 机遇与挑战,传统理念的限制 单一组分定性定量分析 分辨率低的问题 谱图的重叠现象严重 灵敏度低的问题 指标成分含量较低 准确度不高的问题 具有一定的模糊性 重复性问题 相比

2、较最好,一、红外光谱法与中药鉴定 需要解决的难题,常用的红外光谱技术（中红外光谱，MIR）通常被用来作为单一组分的定性和定量分析。在定性分析时，主要依赖于数据库的检索。 但由于数据库既庞大，价格又昂贵，难于广泛的推广和普及。大大的限制了红外光谱的广泛应用。,传统理念的限制,近红外光谱法（NIR）借助于化学计量学进行混合物体系的多组分定性、定量分析是一个现代的分析技术 现已逐渐成熟并被广泛地应用在各个学科领域。,而将红外光谱法直接应用于中药和食品的整体结构解析，业内人士一直以来认为这是一个“禁区”。 这是因为像中药这样复杂的混合物体系会严重地造成红外谱图的叠加，样本间谱图极为相似，难于区分和鉴别

3、。,IR spectra of cell-cultured saffron, Spain and Indian saffron,如何解决谱图的重叠现象； 如何区分相似谱； 如何提高谱图的分辨率； 是解决这一问题的关键。,IR spectra of different kinds of TCM materials,二、红外光谱技术的发展,1800年英国天文学家Hershel发现红外辐射 此后，采用红外辐射观察物质的吸收光谱 1905年，发现了一些吸收谱带和基团间的相互关系 20世纪50年代，收集了大量单一组分的标准红外光谱图,光栅分光 优点：提高了分辨能力，扩大了测量范围 缺点：扫描速度较慢,光

4、栅型红外光谱仪 的工作原理图,分光系统的不断更新光栅分光,迈克尔逊干涉仪分光系统 优点：扫描速度快、分辨率高、光通量大、测量范围宽,FTIR的工作原理图,分光系统的不断更新干涉分光,傅里叶变换红外光谱仪的各种波段、各种附件、各种软件和多种联机系统使它在各个学科领域已发挥了和正在发挥着巨大的作用。,近红外区：100004000cm -1 （高频、高能） 中红外区：4000400cm-1 远红外区：40010cm-1 （低频、低能）,正己烷,甲苯,庚酸,常见有机化合物的红外特征吸收,分子的振动,中红外采样系统（4000-400cm-1） 透射法： 应用广泛（多学科领域，如石油、化工、材料和环境等）

5、 操作简便 仪器价廉 常规的压片法、液膜法和糊状法,与此同时，各种附件的开发和研制也为中红外光谱法注入了新的活力。,ATR for liquid & solid samples,Diffuse reflectance for powder,固体样品检测：收集普通红外无法测量的厚度大于0.1mm的塑料、高聚物、橡胶和纸张等样品 液体样品检测：注射剂、汤剂和葡萄酒等,Attenuated Total Reflectance, ATR,近红外采样系统 （10000-4000cm-1） 应用广泛 操作简便 穿透深度深 较少受表面 污染 同时测定多个指标 软件技术,当然，人们并不只满足于仪器本身的发展，

6、为了拓宽红外光谱的应用领域，多种多样的联用技术应运而生。,GC/FTIR,TGA/FTIR,Raman/FTIR,Micro/FTIR,二维相关红外光谱法（Two-dimensional Infrared Correlation Spectroscopy，简称2DIRCOS）是1986年Noda首先提出来的一种建立在对红外光谱信号时间分辨检测的基础上的一种新技术 在1993年Noda 又提出了广义的二维相关谱（Generalized Two-Dimensional Correlation Spectroscopy）的概念 进而发展了二维近红外相关谱、二维拉曼相关谱、二维荧光相关谱、二维液相色谱

7、相关谱，甚至酸碱滴定相关分析，以及红外-拉曼杂合谱等。,二维相关谱最大的特点是提高谱图的表观分辨率以及研究物质的相互作用机理，它已在不同的学科领域得到了很多成功的应用。 但仅限于一些简单的混合物体系，像中药和食品等相当复杂的混合物体系采用二维相关光谱法进行系统的研究国内外的文献报道还很少。 我们课题组从1998年起首次提出并开始采用该二维相关红外光谱技术进行了系统的分析研究。,八年来我们主要采用这种二维相关红外光谱法和二阶导数谱以及模式识别技术，从简单到复杂逐步探讨了若干种难于区别的中药材、中药饮片和中成药的整体结构组成、相关的指纹特征与相对含量的变化规律。 针对不同的研究对象， -根据相似度

8、的不同建立了相应的评价系统，提出并制定了“三级评价标准” -根据分辨率的不同建立了相应的鉴定系统，提出并制定了“三级鉴定法”，,在学术上突破了原有的“学术理念”，创建了“红外宏观指纹法”。 在基础研究上与各大中医院校和中医药研究院所合作，注重于理论依据的可靠性 在应用上以典型企业为支撑点，验证方法的可行性 在制定方法标准上与权威的检验与检测机构合作，以便于方法标准的可行、实施和推广。于2004起草了国家标准方法，2005年通过专家审定，2006年形成了报批稿。,出版了一本专著 中药二维相关红外光谱鉴定图集，化学工业出版社，2003年 获得了三个发明专利 ZL 03104765.3 中药材 ZL

9、 03122935.2 中药配方颗粒 ZL 03123389.9 中药注射剂,发表了100多篇文章 基本上探索和建立了一套有关中药材、中药饮片和中成药的红外光谱技术鉴定系统。 同时也将该方法扩展到了食品体系的研究,Papers(100) Xu CH, Sun SQ*, Guo CQ, et al.，Multi-steps infrared macro-fingerprint analysis for thermal processing of Fructus viticis，VIBRATIONAL SPECTROSCOPY 41 (1): 118-125 MAY 30 2006 Liu HX,

10、 Sun SQ*, Lv GH, et al. Discrimination of extracted lipophilic constituents of Angelica with multi-steps infrared macro-fingerprint method，VIBRATIONAL SPECTROSCOPY 40 (2): 202-208 MAR 17 2006 Zhou Q, Sun SQ*, Zuo L, Study on traditional Chinese medicine Qing Kai Ling injections from different manufa

11、ctures by 2D IR correlation spectroscopy, VIBRATIONAL SPECTROSCOPY 36 (2): 207-212 DEC 6 2004 Li YM, Sun SQ*, Zhou Q, Qin Z, Tao JX, Wang J, Fang X Identification of American ginseng from different regions using FT-IR and two-dimensional correlation IR spectroscopy, VIBRATIONAL SPECTROSCOPY 36 (2):

12、227-232 DEC 6 2004 Hua R, Sun SQ*, Zhou Q, Noda I, Wang BQ, Discrimination of Fritillary according to geographical origin with Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy, JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS 33 (2): 199-209 SEP 19 2003 Zuo L,

13、 Sun SQ*, Zhou Q, Tao JX, Noda I, 2D-IR correlation analysis of deteriorative process of traditional Chinese medicine Qing Kai Ling injection, JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS 30 (5): 1491-1498 JAN 1 2003,既然中药材、中药饮片和中药制剂是多种成分的混合物，其红外光谱图谱是中药所含各成分吸收光谱的叠加，中药正品、伪品中的化学物质，不论他们之间存在的不同物质是什么

14、，必定在其红外光谱上有所反映。 只要药材中所含的化学成分不同，各成分含量的比例不同，就会导致红外谱图的差异。 凭借红外光谱的这些差异特征（峰位、峰强度和峰形状），即“宏观指纹性”，并对原红外光谱进行导数计算和二维相关分析等计算机辅助技术可以用来识别中药的真伪优劣。 这种对复杂体系（譬如中药）原红外光谱的指纹特征提取和二阶导数分辨率增强法以及二维相关分析等计算机辅助技术鉴定法定义为“红外宏观指纹法”,三、理论基础-“红外宏观指纹法”,从中医药的观点看，指标成分的控制，难以真正控制中药功效。中医辩证施治用的是药味而非某个化学成分。 所以要控制中药功效，不能只针对某个化学成分，必须对方剂物质群整体予

15、以控制。中药内含物质群是个很复杂的问题，要把质量控制建立在研究清楚每个内含成分的基础上是很困难的。 这就需要在尚不清楚全体化学成分的情况下，实现对物质群整体的控制。,不同产地或者同产地不同季节的中药材一些被公认的“有效成分”之间的差别也比较大，有些药材在10-102倍之间波动。 而这些在中药里占1%-0.1%的“有效成分”不代表整体的有效成分，中药是多种成分相互协调共同作用的结果。,另外,因此中药在质控上，不应该也没有必要对中药进行逐个成分的分析鉴定，而应从宏观整体上对其鉴定研究。 这样不仅简化了操作难度，而且在不破坏其自然规律的基础上进行宏观“调控”。 光谱比对（相似度评价），二阶导数谱和二

16、维相关分析以及模式识别技术（聚类分析）等就属于这种的典型方法。,Perkin-Elmer公司的定性分析软件-比对软件（Compare），是根据数学上的相关系数比较两个红外光谱之间（或一个光谱和一系列光谱之间）的相似程度。 比对软件强调的是谱图中与化学组成有关部分的相似度，为了去除（或降低）仪器的噪音、空气中水和二氧化碳所产生的干扰，在比对软件中可以选择一些数学“过滤器”来辅助减少这些外界的影响。,-光谱比对的基本原理,这些过滤器包括有：,分辨率权重：即加权的导函数，它用于突出峰宽在8-16cm-1之间的特征吸收的影响，可由此区分吸收峰与宽基线和高频噪音的差异。 强度权重：用于降低谱图两端低信噪

17、比处数据的影响。 噪音权重：用于降低透过率较低处数据的影响，因为这些数据往往噪音较大。 CO2空白：删除2390-2280cm-1间的所有数据。 H2O权重：为了降低7450-6950cm-1和5600-5100cm-1（近红外光谱图）、4000-3500cm-1和1900-1300cm-1（中红外光谱图）区域内水的影响，把以上范围内的权重都规定为8 H2O空白：删除7450-6950cm-1和5600-5100cm-1（近红外光谱图）、4000-3500cm-1和1900-1300cm-1（中红外光谱图）区域内的所有数据,2,/,1,2,/,1,),(,),(,=,i,i,i,i,i,i,i

18、,i,i,B,B,w,A,A,w,B,A,w,l,光谱比对是对吸收光谱的定性比较，因此可以忽略由于浓度或光程长度所产生的差异。其相关系数定义为：,其中，Ai和Bi是光谱A和光谱B在频率i处的吸光度，而wi是所选过滤器在频率i处的权重，如果在比对过程中选择了不止一个过滤器，则wi为每个权重的加权权重。,-导数光谱的基本原理,导数光谱也叫微分光谱，是用计算机对原始光谱数据进行微分处理而得到的吸光度对波长（或波数）的变化率曲线 实际就是在整个区域内沿原始光谱曲线计算出的每个数据点处的斜率曲线。 随导数阶次的递增，依次可得到一阶导数光谱、二阶导数光谱、n阶导数光谱，其吸收带宽依次变窄，峰形变锐，光谱分

19、辨率提高。,在以往的红外光谱分析中，其应用并不受重视，主要原因是由所检测样品特点决定。 在传统的红外光谱分析中，首先要求采用各种化学分离手段纯化样品，保证样品纯度达98%以上，因此样品对应的红外光谱图具有吸收谱带窄、吸收峰较多、重叠少、吸收强度大、专属性强等特征，已能提供相当的信息来满足谱图解析的要求。,中药和食品等复杂的混合物体系使得红外吸收谱带变宽，吸收峰不明显，特征性差、专属性明显降低。 而导数光谱可以提高分辨率，增大信息量，增强信息品质，突出谱图特征性，能很好的分辨谱图中重叠的峰， 故其在紫外光谱中应用的特殊作用也同样适应于混合物的红外光谱分析中。,尤其是二阶导数谱，它的半峰宽只有原谱

20、图半峰宽的1/3左右，它能够容易地分辨出强峰两侧的小肩峰，在正确测定峰位及确定肩峰位置时很有用，基本上达到了提高谱图分辨率的目的，这对测定峰位及确认肩峰非常有效。 尽管四阶导数谱的半峰宽更窄，为原谱图的1/5左右，谱图的分辨率高于二阶导数谱，但它对原谱的质量要求更高，噪音的影响较大，故我们不加以采用。因此二阶导数谱被作为红外光谱技术鉴定中药的手段之一。,由野田勇夫（Isao Noda）等人在80年代后期创立。 它的产生受二维核磁共振谱的启迪，二维相关红外图形外观及其解释也与二维核磁共振谱中的同核位移相关谱类似。,-二维相关红外光谱的基本原理,人们使用某种微扰以激发被测体系的分子。此微扰是周期性

21、的，被激发的分子的驰豫过程慢于红外光谱的时标，因而可用前述的时间分辨技术，检测动态过程，经处理得到二维红外光谱。,),（Perturbation）,（Electro-magnetic Probe）,（Sample System）,（Dynamic Spectra）,（2D Correlation Spectrum）,（2D Correlation Analysis）,经计算有：,画出同步、异步相关强度为两个独立波数v1、v2的图就得到二维相关红外谱。,（9）,（10）,图a 二维同步相关谱 图b 二维异步相关谱,外观及其解释,处于非主对角线处的峰称为交叉峰（Cross peaks）。当两个独立

22、波数处的动态IR信号彼此相关或反相关时，就会出现交叉峰。交叉峰可正可负。交叉峰的出现说明在官能团之间存在着相互作用，这些作用可以限制他们独立的变向运动。当两个不同官能团的振动相应的暂态电偶极矩以同一方向发生变化，就产生一个同相交叉峰；当两个不同官能团的振动相应的暂态电偶极矩发生相反方向的变化，则产生一个异相交叉峰。,图a 二维同步相关谱,同步相关光谱是关于对角线对称的。在主对角线上处有一组峰，它是动态IR信号自身相关得到的，称为自相干峰（Autopeak）。自相干峰总是正峰，它们代表吸收峰带对一定微扰的敏感程度。如果IR信号的动态变化代表了电暂态偶极矩的重新取向，同步2D IR相关谱中的自相干

23、峰则代表了重新取向的难易程度，以及化学基团对静态偶极矩所做的贡献。,同步相关,二维异步相关谱仍呈正方形，但无对角线峰，仅有对角线外的峰，即交叉峰。异步相关谱中的交叉峰表明与它相应的两个红外吸收的偶极跃迁矩的重定向行为是独立的，因此这种“相关峰”正好说明与这两个吸收相对应的官能团没有相互连接、相互作用的“相关”。 异步相关谱也有正、负号之分，它反映了所对应的两个偶极跃迁矩重定向的相对快慢。一个正的交叉峰说明在v1处的光谱强度的变化比在v2处的变化提前发生，而负的交叉峰则恰恰相反，说明在v2处的光谱强度的变化比在v1处的变化提前发生。,图b 二维异步相关谱,异步相关,一级鉴别（定）：利用被测样本的

24、红外图谱与相对标准的，或道地的药材或制剂直接进行比对，便可鉴别中药的真伪与优劣。这样的鉴别（定）称之谓一级鉴别（定）。 二级鉴别（定）：然而采用常规的红外图谱还不足以鉴别时，可利用样本的二阶导数谱进行分析比对，这样的鉴别（定）称之谓二级鉴别（定）。这是因为二阶导数谱的分辨率较高，可增强谱图的指纹特征。 三级鉴别（定）：有些样本，常规的红外图谱及其二阶导数谱的宏观指纹性仍不足以鉴别时，则可利用相同热微扰下的二维相关红外同步谱进行对比，这样的鉴别（定）称之谓三级鉴别（定）。它利用了试样组分在热微扰下红外行为的不一致性，增强其宏观指纹性。,四、判别准则-三级鉴定,基本概念,红外光谱一级鉴定 获得混合

25、物样本优质的原始谱图 选点归一化法 谱图的“指纹特征提取” 和局部放大法 相似度评价的标准（三级限定法） 二阶导数谱二级鉴定 多区对比法和局部放大法 二维相关红外分析三级鉴定 多区对比法和自动峰曲线比较法,核心技术,获得混合物样本优质的原始谱图 选点归一化法 谱图的“指纹特征提取” 和局部放大法 相似度评价的标准（三级限定法）,红外光谱一级鉴定,藏红花培养细胞,西班牙产干红花,印度产干红花,谱图的“指纹特征提取” 多区“局部放大法”,譬如：,第二种类型（二级评价标准），若未知样本的红外光谱图与纯物质的标准谱相似度较高，相关系数90%，我们可以判断该样本含有大量的该类物质。 譬如： 冬青油的红外

26、谱图与水杨酸甲脂相关系数90%，我们就可以说正红花油里含有大量的水杨酸甲脂。,中药生产厂家的指标成分快速检验,Methyl salicylate,譬如：冬青油,相关系数90%,第三种类型（三级评价标准） ，若未知样本的红外光谱图与不只一种的已知纯化合物的标准谱相似度较高，相关系数90%，我们可以判断该未知样本中含有这两种物质。 如 ：薄荷油中即可以观察到薄荷酮的指纹特征峰，也可以观察到薄荷脑的指纹特征峰，基本上我们就可以说在薄荷油中含有这两类物质。,中药生产厂家的多指标成分快速检验,譬如：薄荷油的分析,相关系数90%,C10H18O,C10H20O,menthol,采用常规的红外图谱还不足以鉴

27、别时，可利用样本的二阶导数谱进行分析比对，这样的鉴定称之谓二级鉴定。 这是因为二阶导数谱的分辨率较高，可增强谱图的识别能力。 二阶导数谱可以进行多区放大法和多区（多波段）比较法。,二级鉴定,譬如：移山参不同年限,有些样本，常规的红外图谱及其二阶导数谱的宏观指纹性仍不足以鉴别时，则可利用相同热微扰下的二维相关红外同步谱进行对比，这样的鉴定称之谓三级鉴定。 它利用了试样组分在热微扰下红外行为的不一致性，增强其宏观指纹性。 详细的内容请参考中药二维相关红外光谱鉴定图集一书。,三级鉴定,山茱萸,山茱萸（20）山楂（80）,山楂,山茱萸（10）山楂（90）,譬如：山茱萸的掺伪分析,由于一维红外光谱具有优

28、质的信噪比，可以作为鉴定的基础。 高分辨率的二阶导数谱可以确定确切的峰位置、峰个数，适用于谱图相似度较大的药材的鉴定。 二维相关红外光谱可以观察样本的动态信息，在提高分辨率的基础上获得物质由于外界的微扰而引起物质官能图总体的结构变化。,举例一 淫羊藿(不同品种) 举例二 地黄(不同炮制品) 举例三 不同配方颗粒（肉豆蔻和乳香） 举例四 油剂(正红花油),五、应用举例,相关物质宏观结构鉴定,淫羊藿苷,药材,醇提物,举例一 淫羊藿,药 材,醇提物,淫羊藿苷,二阶导数谱,相关物质宏观结构鉴定,心叶淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,朝鲜淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,相关系数比对法-药材,相关物质宏观结构鉴定-醇提物,心叶淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,朝鲜淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,淫羊藿与淫羊藿苷相关系数比对结果,相关系数法宏观分类醇提物,原药材,酒炖0小时,酒炖20小时,中药炮制品熟地黄,举例二 中药饮片,原药材,酒炖0小时,酒炖20小时,a.原药材,b.酒炖0h,c.5h,d.10h,e.15h,f.20h,g.30h,h.40h,i.50h,j.60h,地黄酒炖不同时间的一维红外和二阶导数谱,0h,5h,10h,