核苷酸与核酸NucleotidesandNucleicAcids.ppt

1、第 六 章核苷酸与核酸Nucleotides and Nucleic Acids,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,核酸的发现和研究工作进展,1869年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美

2、国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,第一节 核酸概述 The Generality of Nucleic Acids,一、核酸的基本结构单位是核苷酸,核酸在核酸酶的作用下水解成核苷酸。,二、核苷酸由碱基、戊糖、磷酸组成,核苷酸由碱基(base)、戊糖(pentose)和磷酸3种成分以共价键依次连接而成。,核酸的化学组成,元素组成 C、H、O、N、P（9%10%）,分子组成, 碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱 戊糖(pentose)：核糖，脱氧核糖 磷酸(phosphate),（一）核酸中的碱基分为嘧啶碱和嘌呤碱两

3、类,1核酸中常见的5种碱基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),2核酸中存在稀有碱基,核酸中还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基(rare base)。稀有碱基种类很多，大多数都是甲基化碱基。tRNA中含有较多的稀有碱基，可高达10%。,核酸中部分稀有碱基,（二）核苷酸中的戊糖有核糖和脱氧核糖两类,核糖核苷酸：-D-核糖 脱氧核糖核苷酸： -D-2-脱氧核糖,戊 糖,H,（三）碱基和和戊糖缩合成核苷酸,1.碱基和戊糖缩合成核苷 -N-糖苷键 2.糖苷键是可以旋转 碱基位置存在顺式和反式结构,顺式鸟嘌呤核

4、苷,反式鸟嘌呤核苷,反式胞嘧啶核苷,反式胞嘧啶脱氧核苷,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,（四）核苷与磷酸以酯键连接成核苷酸,腺嘌呤核苷三磷酸 ATP,腺嘌呤脱氧核苷一磷酸 dAMP,环式腺苷一磷酸cAMP,环式鸟苷一磷酸cGMP,鸟苷四磷酸 ppGpp,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,三、核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接成多聚核苷酸,（一）3, 5-磷酸二酯键是

5、核酸的基本结构键,3, 5-磷酸二酯键,（二）多聚核苷酸链有方向性,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,目 录,四、核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类,（一）RNA是单链多聚核糖核苷酸 （二）DNA是单链或双链多聚脱氧核糖核酸 （三）组成DNA和RNA成分不同 （四）多聚核苷酸中核苷酸的排列顺序是核苷酸的基本结构,五、核苷酸还有其他功能,脱氧核苷酸主要的作用是DNA的组成成分，为数不多的参与代谢的调节。 核糖核苷酸除了是RNA的组成成分外，还以多种方式参与细胞内的生理和生化过程。,第二节 DNA的三维结构 The Three Dimensional

6、 Structure of DNA,DNA的二级结构是双螺旋结构 DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义 DNA双螺旋结构模型要点 DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装 DNA的超螺旋结构 原核生物DNA的高级结构 DNA在真核生物细胞核内的组装 DNA的功能,基本内容,一、 DNA的二级结构是双螺旋结构,（一）Waston和Crick提出DNA双螺旋结构模型,目 录,不同生物来源的DNA碱基组成(摩尔，mole)与碱基比（mole比）, 包括5-甲基胞嘧啶 比值偏离1 ：1是实验误差所致,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕

7、同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,（二） DNA双螺旋结构具有特征性 （Watson, Crick, 1953）,1、DNA是反向平行的互补双链结构,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,2、DNA双链为右手螺旋结构,DNA双链模型,碱基互补配对,T,A,G,C,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,3、疏水力和氢键维系DNA双螺旋的稳定,Watson-Grick和Hoogstee

8、n DNA螺旋中碱基对间氢键的位置,（三）DNA双螺旋结构具有多样性,目 录,不同类型的DNA双螺旋结构,A、B和Z型DNA分子的比较,（四）某些DNA 具有更复杂的螺旋结构,H-DNA的结构,1. Hoogsteen碱基配对 形成三股螺旋DNA,2 4条多聚鸟嘌呤核苷酸链形成四螺旋DNA,碱基序列依赖性的局部DNA 可形成发夹形或十字形结构,3.在特异碱基序列基础上DNA局部可形成特殊结构,二、DNA的三级结构是超螺旋结构,DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘

9、绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（一）原核生物DNA的是环状超螺旋结构,（二）真核生物的线粒体、叶绿体DNA也是环状超螺旋结构,真核细胞中含有核外遗传物质的细胞器。线粒体DNA(mtDNA)是一个封闭的双链环状分子。人mtDNA全长16,569个碱基对，共计37个基因, 分别编码13个蛋白质、2个rRNA、22个tRNA。,（三）拓扑异构酶改变超螺旋的数量和类型,环状DNA的三种拓扑异构体示意图,1核酸分子具有拓扑同分

10、异构体,2拓扑异构酶（Topoisomerase）催化DNA连环数的改变,概念：能够引起拓扑异构反应的酶。 作用：对DNA分子的作用是既能切开又能连接磷酸二酯键，使DNA不至于打结，适当时候又把切口封闭，使DNA的拓扑异构体发生改变。 类型：大肠杆菌至少有2型4种拓扑异构酶。型拓扑异构酶包括拓扑异构酶和拓扑异构酶 ，其功能是去除负超螺旋而松弛DNA ；型拓扑异构酶包括拓扑异构酶和拓扑异构酶，其功能是引入负超螺旋 。 真核生物细胞同样有I型拓扑异构酶和II型拓扑异构酶。I型拓扑异构酶，包括拓扑异构酶I 和III；II型拓扑异构酶，包括拓扑异构酶II和II。与原核生物的拓扑异构酶不同，真核生物的拓

11、扑异构酶I能消除负超螺旋也能消除正超螺旋，拓扑异构酶III只消除负螺旋，但活性较低。,三、真核生物DNA与组蛋白组成高度有序的染色体,（一）核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成 。,1 双链DNA缠绕在组蛋白核心上构成核小体 DNA：约200bp 组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4,核小体的结构示意图,a 组蛋白八聚体核心 b 核小体 c 直径30nm纤维的剖面图显示H1的位置 d 核小体组成串珠样的染色质,a,c,b,d,2组蛋白是小分子量的碱性蛋白质,组蛋白分子质量在11kD到21kD之间，组蛋白中富含精氨酸和赖氨酸。各种真核细胞都有5种组蛋白，

12、但分子质量和氨基酸的顺序有些差异。在所有真核生物中H3，H4组蛋白氨基酸序列高度保守，提示功能是相同的。但是各种生物的H1、H2A、H2B的相似性很少。,（二）核小体进一步组装成染色质/染色体,1核小体组成30nm纤维,2螺线管进一步折叠、包装为染色质和染色体,端粒,着丝粒,端粒,端粒和着丝粒的结构示意图,基因，分散的重复序列和多重复制起点,（三）真核生物染色体有端粒和着丝粒两个功能区,端粒酶,端粒酶RNA,模板DNA结合蛋白,TRF1和TRF2,端粒结构,a 端粒末端DNA序列和端粒酶及端粒酶中的RNA序列 b 端粒末端结构示意图,1端粒是染色体末端的结构,图 a,图 b,2着丝粒是连接两个

13、染色单体的中心部位,着丝粒（centromere）在有丝分裂时，使染色体均等有序地进入子代细胞。着丝粒是一段DNA序列，富含AT碱基对。酵母着丝粒长130bp，序列简单，而高等真核生物细胞的着丝粒很长，含有上千个串联的短序列拷贝，短序列的方向是相同的。着丝粒中的重复DNA序列在不同的物种间变化很大，说明这些序列的进化速率很快。着丝粒中这种比较简单的DNA的确切功能依然不清楚。,四、DNA是遗传的物质基础,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序

14、决定了基因的功能。,（一）肺炎球菌转化证明DNA传递遗传信息,（二）细胞中全部遗传信息称为基因组,基因组（genome）就是一个细胞或病毒的全部遗传信息。绝大多数生物个体的基因组是DNA，但有些病毒的基因组是RNA。,（三）常染色质与异染色质的DNA活性不同,常染色质（euchromatin），相对比较伸展，是基因表达活跃区域。对DNase敏感。 异染色质（heterochromatin），折叠压缩程度较高，是转录不活跃的区段，占染色质的10%，如着丝粒、端粒等。,第三节 RNA的结构与功能 RNA Structure and Function,RNA的一级结构 RNA分子中各核苷之间的连接方

15、式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构. 线性结构，部分区域是双螺旋 核糖 碱基:A U C G 稀有碱基(tRNA),一、动物细胞内有4大类RNA,动物细胞内主要的RNA种类及功能,二、信使RNA具有共同的基本结构框 架和编码功能,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,外显子 (exon),目 录,（一）5-端具有共同的帽结构 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一、二个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。 mRNA的帽结构可以与一类称为帽结合蛋白（cap binding proteins, CBPs）的分子结合。这种

16、mRNA和CBPs复合物对于mRNA从细胞核向细胞质的转运、与核蛋白体的结合、与翻译起始因子的结合以及mRNA稳定性的维持等均有重要作用。,帽子结构,真核mRNA的5-末端7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化,O,真核mRNA的5-末端7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化,5帽子结构功能,可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。,（二）3-末端具有多聚A尾结构 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸poly(A)结构，称为多聚A尾。 Poly(A)在细胞内与Poly(A)结合蛋白Poly(A) binding

17、 protein, PABP)相结合而存在，每1020个碱基结合一个PABP单体。所以，真核细胞的mRNA的3-端实际上是一个Poly(A)和蛋白质多聚体形成的复合物。,mRNA核内向胞质的转移 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,3polyA结构功能,（三）信使RNA中间序列编码多肽链 mRNA把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。 mRNA分子从5-末端的AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码(triplet code)或密码子(codon)。由AUG及其后的连续三联

18、体密码(无终止信号)组成的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame，ORF)，是多肽链的编码序列。,真核生物的mRNA与原核生物的mRNA的区别,从分子结构上来看，真核生物和原核生物的mRNA是完全一样的，都是核糖核酸，由四种核糖核苷酸组成，并且都是由基因转录而来。但两者有很多区别，如下：（1）原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。 （2）原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。（3）原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟。真

19、核生物mRNA的半寿期较长，有的可达数日。（4）原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。真核生物mRNA由5端帽子结构、5端不翻译区、翻译区、3端不翻译区和3端聚腺苷酸尾巴组成，原核生物mRNA无5端帽子结构和3端聚腺苷酸尾巴。,（一） tRNA分子含有较多稀有碱基 含 10% 20% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,三、转运RNA具有特征性的分子结构,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,tRNA中常见的稀有碱基,1. DHU环 2. 反密码环 3. 额外环 4.TC环 5. 氨基酸臂,氨基酸臂末端CCA-OH

20、,T环 识别核糖体，促使tRNA与核蛋白体结合,额外环3-18个核苷酸 是tRNA分类的指标,三联密码子,DH环 与氨基酰tRNA合成酶结合有关,酵母丙氨酸tRNA二级结构,（二） tRNA的二级结构形似三叶草,4,5,5,7,（三） tRNA的三级结构是倒L型,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,环,氨基酸臂,DHU环,反密码环,反密码子,tRNA三级结构及氢键的位置,* rRNA的结构,四、核糖体RNA的结构更复杂,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 2

21、3S rRNA 16S rRNA,（一）原核生物的有3种rRNA，真核生物有4种rRNA,（二）原核生物和真核生物的核糖体均由容易解聚的大、小两个亚基组成。,rRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体，是蛋白质生物合成的场所：为肽链合成所需要的mRNA、tRNA、多种蛋白因子提供了相互结合的位点和相互作用的空间环境。,（三）核糖体是蛋白质合成的场所,五、细胞内尚有大量其他小分子RNA,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,snmRNAs的种类 核内小RNA

22、 核仁小RNA 胞质小RNA 催化性小RNA 小片段干涉 RNA,（一）细胞核内小RNA参与mRNA前体的剪接过程,（二）催化性RNA也参与特殊RNA剪接,一些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，在RNA合成后的剪接中具有重要作用。这种具有催化作用的小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA (catalytic RNA) 。,（三）核仁小RNA参与rRNA中核苷酸残基的修饰,（四）小干扰RNA参与转录后调控,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学,

23、第 四 节 核 酸 的 理 化 性 质 Physical-chemical Characters of Nucleic Acids,目 录,核酸的酸碱及溶解度性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性。 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇,一、核酸可被酸、碱水解,目 录,核酸中的糖苷键和磷酸酯键都能被酸、碱和酶水解。,1 酸水解 对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。 2 碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感。 DNA抗碱水解。 生物学意义： DNA更稳定，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,3 酶水解 （1）非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒

24、磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸 （2）特异的磷酸二酯酶 核酸酶 （3）N-糖苷酶,二、核酸是两性化合物,（一）碱基可发生互变异构,（二）碱基在体液环境中以碱性解离为主 核酸的两性性质及等电点 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 （三）核酸分子是酸性化合物,三、核酸溶液有

25、高分子性质,粘度 ： DNA RNA dsDNA ssDNA 沉降系数： 溶液中的核酸在离心力场中可下沉。DNA分子经反复盘曲形成超螺旋后，其沉降系数增加，超螺旋松解后其沉降系数减小。,四、核酸有紫外线吸收的特性,核酸的紫外吸收（OD260） 单核苷酸 ssDNA（或RNA） dsDNA,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2. 判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,五、核酸具有变性、复性和杂交行

26、为,定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降 比旋度下降浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,（一）核酸变性时空间构象破坏,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260(absorbance, A, A260代表溶液在260nm处的吸光率)值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：变性是

27、在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。 影响因素： 1DNA均一性决定熔解温度范围大小； 2G-C碱基对含量决定熔解温度高低； 3介质中的离子强度影响变性。,（二）Tm值是DNA变性的重要参数,（三）变性的核酸可以复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,1变性的核酸可复性,2. 具有同源序列的核酸分子可相互杂交,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链（heteroduplex）。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子之间或者RNA和RNA分子之间形成。这种现象称为核酸分子杂交（hybridyzation）。,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交