基因工程体外重组.ppt

1、第六章 DNA重组的操作,基因工程,外源DNA,载体DNA,重组分子,连接,？,1.基因文库 2.PCR 3.基因差异表达,第一节 DNA的体外重组,限制酶 分子剪刀,限制酶 分子剪刀,连接酶 分子胶水,重组DNA分子,粘性末端连接效率最高！,黏性末端,黏性末端,1、粘性末端的连接,第一节 DNA的体外重组,1. 粘性末端连接,创造互补粘性末端的方法有哪些？ 同种酶 同尾酶,第一节 DNA的体外重组,（1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接,第一节 DNA的体外重组,碱性磷酸酶：去掉其5末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 注意： 目的基因正反向插入； 载体与多个目的基因片段重组。

2、,1,2,3,1,2,3,4,4,3,4,第一节 DNA的体外重组,（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接,两种不同的限制性内切酶 两端会产生非互补的突出端 定向重组体,第一节 DNA的体外重组,质粒载体的定向重组,碱性磷酸酶？,避免了目的基因正反向插入,2. 平头末端连接,第一节 DNA的体外重组,平末端平末端,SmaI限制酶,第一节 DNA的体外重组,T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,（1） 直接连接,第一节 DNA的体外重组,（2） 人工加尾形成 “粘性末端” a）同聚加尾 法 DNA末端转

3、移酶 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸, 利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,第一节 DNA的体外重组,非酶切位点,a）同聚加尾法,缺点：不能把插入片段再切下来。,第一节 DNA的体外重组,还有哪些方法能够创造粘性末端？,第一节 DNA的体外重组,b）衔接物(linker)连接 Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：,第一节 DNA的体外重组,衔接物(linker)连接,第一节 DNA的体外重组,衔接物(linker

4、)连接,优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,第一节 DNA的体外重组,c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,第一节 DNA的体外重组,缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 防止自我连接： 先用碱性磷酸酶（CIP）处理接头 以后

5、再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。,DNA接头 (adapter)连接法,平头末端连接 （1） 直接连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法,小结,PCR?,第一节 重组DNA分子的构建,3.PCR产物的连接 （1）在引物的5端设计酶切位点,GCAGAATTC,互补序列,3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列,（5端多余的35bp属保护碱基）,引物,第一节 DNA的体外重组,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC

6、,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,第一节 DNA的体外重组,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,3-,模板,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,引物2,3,3,第一节 DNA的体外重组,BamH I,EcoRI,质粒载体的定向重组,PCR,第一节 DNA的体外重组,（2）与T载体直接连接 Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3端一般都有一个A T载体的两个3端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合

7、酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,Taq DNA聚合酶,第一节 DNA的体外重组,T载体图,第一节 DNA的体外重组,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,T A,T A,3. PCR产物的连接 （2）与T载体直接连接,1. 粘性末端连接 （1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 （2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 2. 平头末端连接 （1）直接连接 （2）人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法 3. PCR产物的连接 （1）在引物的5端设计酶切位点 （2）与T载体直接连接

8、,第一节 DNA的体外重组,思考： 怎样进行有效的 DNA体外连接？,第一节 DNA的体外重组,二、DNA体外连接应注意的事项 1.插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。,BamHI,BamHI,Sau3AI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。,第一节 DNA的体外重组,2. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,双酶切,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,第一节 DNA的体外重组,（2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATG G AA TTC,载体,ATG CGG AAT TCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATG G AAT TCT,重组,但移码突变！,3. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。,三、载体和外源DNA插入