金属离子螯合层析.ppt

1、金属离子亲和层析的应用,目录,一、亲和层析 二、金属离子亲和层析 三、金属离子亲和层析的应用 四、金属离子亲和层析的局限,一、亲和层析,亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法,因此其专一性、选择性是极高的。,亲和层析的过程,1、寻找可与底物专一可逆结合的配基 2、将配基通过共价键偶联到基质，并要求偶联后配基与配体的亲和力不变 3、配基与配体吸附并与杂质分离，将杂质洗出 4、洗脱目标物,亲和层析的分类,1、生物亲和层析 2、免疫亲和层析 3、金属离子亲和层析 4、有机染料亲和层析 5、拟生物亲和层析,二、金属离子亲和层析（IMAC）,金属离子亲和层析是建立在蛋白质表面暴露

2、的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离纯化的一项技术 金属离子：锌、铜、铁等 氨基酸残基：组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基,金属离子亲和层析优点,1、配基简单，吸附容量大 2、价格便宜，投资低 3、通用性强 4、分离条件温和 5、金属离子配基具有很好的稳定性，且层析柱可长期连续使用，易于再生。,三、金属离子亲和层析的应用,纯泰Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料（His镍柱）,（一）、用于分离纯化变性蛋白,金属离子亲和层析复性中，蛋白质能可逆吸附在固相介质上，可避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。在高浓度变性剂存在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸附在金属离

3、子亲和层析介质上的能力，所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化。蛋白质吸附在IMAC介质上后，先逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF蛋白，使用IMAC可获得90的复性收率。,（二）、用于蛋白质分析鉴定,1、1）科学家通过金属离子亲和层析对糖基化导致一胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究，证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质，他们对金属离子的亲和性完全相反。 2） 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体代谢调控的重要机制，已发现IMAC能鉴定磷酸化的蛋白，其中Fe3-IMAC已被用来选择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽。,2、IMAC与重组技术相结合可以

4、使带六聚组氨酸的蛋白质固定在基质上，从而为研究蛋白质的相互作用开辟了新的途径。 例：Celia等用Ni2+负载的金属螯合脂质定向 膜捕获组氨酸MHC分子，再通过表面等离子体共振技术考察它们对 T细胞受体的结合。,（三）、用于提取目的蛋白,在基因重组过程中加入聚组氨酸六肽作为亲和标识物来分离纯化目的蛋白,（四）、用于核苷酸的纯化,IMAC也可以应用于核苷酸的纯化，比如用组氨酸标记的PCR产品，单链、双链核苷酸及嘌呤等 例：从质粒DNA产物中除去被损坏的染色体DNA,（五）、其他应用,过渡金属亲和吸附蛋白的特性也成功应用在生物传感器和蛋白质芯片领域。 例：Zhu等提到了将带有6个组氨酸的蛋白质固定于镀镍的玻璃板上 ，得到了比常规醛处理表面更高质量的蛋 白质芯片。,四、金属离子亲和层析的局限,1、对蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附 2、载体上的金