乙肝病毒核酸检测实验操作流程.ppt

1、乙肝病毒核酸检测实验操作流程,广西临床检验中心 唐 娟,主要内容,HBV-DNA的检测原理 HBV-DNA操作流程 HBV-DNA检测结果分析 临床意义,DNA 提取,PCR 扩增,标本采集,检测原理,HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA,原理图,每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,操作流程,一、标本采集,一次性无菌注射器抽取受检者静脉血

2、2毫升，注入无菌的干燥玻璃管 室温（2225C）放置3060 分钟血标本使用水平离心机，4000转/分离心5分钟 吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管,血 清 的 采 集,血 浆 的 采 集,用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管 立即轻轻颠倒玻璃管混合510次，使抗凝剂与静脉血充分混匀 510分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管,注意事项,尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）,血清,血清,不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取过程中完全去除,血浆,二

3、.HBV-DNA的提取,打开HBV-DNA试剂盒 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） 12000rpm，离心10min 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀） （阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul） 100恒温干浴10min 12000rpm离心5min,注意事项,1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不能用移液器混匀 2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴

4、管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至190ul一次性吸取。,注意事项,3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。 4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。 5.裂解温度要确保有1001，裂解时间10min1,三.PCR 扩增步骤,取上清液2ul点样 8000rpm离心数秒 按顺序放进扩增仪微孔中,编辑软件，设置循环条件,保存文件，运行,注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。,循环条件,循环次数、温度 93 2分钟 93 45秒55 60秒10个循环 93 30秒55 45秒30个循环,结果分析,1.,2.结果读取,3.结果报告,结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告多少；也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可，不能报告“0”或阴性,临床意义,1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指 标，为临床提供