生物化学与分子生物学课件：五年制 复制（第八版）

1、基因的分子生物学,福建医科大学 生物化学与分子生物学系 齐元麟,生物化学 第三篇,分子生物学的研究对象是核酸与蛋白质,基因组的维持 DNA的复制 DNA的损伤修复 DNA的重组 基因表达 转录（DNARNA） 翻译（RNA 蛋白质） 蛋白质的翻译后修饰 基因表达的调控（DNA、RNA）,分子生物学发展简史,奠基时代（18691952） 信息学派、结构学派、生化学派 遗传物质是DNA 黄金时代（19531972） 双螺旋（沃森、克里克） 分子生物学所有基本原理于此诞生 基因工程时代（1973 ） 基因工程的诞生与发展 分子生物学技术进入生命科学所有领域,奥斯瓦尔德艾弗里,罗莎琳德富兰克林,詹姆斯

2、沃森 弗朗西斯克里克,分子生物学在医学领域的应用,RFLP技术在法医学中的应用,重组蛋白技术用于药物生产,这些金色的转基因大米里含有 b-胡萝卜素, 食用这种大米可以预防维生素A缺乏症。,本篇课时安排,基因与基因组,第一部分,本章节需要掌握的内容,名词： 基因、基因组、断裂基因、外显子、内含子 知识点 真核基因的基本结构 人类基因组的组成特点,基因,1909，Johansen，基因是传递和表达特定生物性状 的可遗传因子； 1911，Morgan，基因在染色体上呈直线排列； 1944，Avery，基因的本质是DNA； 1955，Benzer，顺反子（Cistron）概念，一个顺反 子就是一个基因

3、，编码蛋白质或RNA，是遗 传功能不可分割的单位。 基因：遗传信息的功能单位，可作为模板表达和产 生RNA或蛋白质。,基因包括两个部分,真核生物基因包括转录调控序列（启动子、增强子）和结构基因两部分。 转录调控序列决定基因是否表达以及表达强度。 结构基因序列从转录的第一个核苷酸开始，到转录结束为止，与RNA原始转录本的序列一致。 真核生物的基因是断裂基因，由外显子与内含子镶嵌排列而成。,断裂基因（split gene）：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相隔开却又连续镶嵌排列而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。 外显子（exon）：

4、断裂基因中，出现在成熟mRNA分子上的序列。 内含子（intron）：断裂基因中，在mRNA剪接过程中被去除部分对应的序列。,真核基因中的内含子一般都大于外显子,转录是以DNA为模板合成RNA的过程，在此过程中，储存在基因组DNA中的遗传信息传给了RNA。 翻译是mRNA中的遗传信息转变为蛋白质的氨基酸序列的过程，蛋白质是遗传信息传递的终末产物。 翻译生成的蛋白质还必须经过加工才能获得生物学活性，包括折叠、修饰、亚基聚合等。 以上步骤统称基因表达。,基因表达（Gene Expression）,弗朗西斯克里克： 我本人的思想是基于 两个基本原理， 序列假说和中心法则。 sequence hypo

5、thesis ： 核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定，而且这种序列是某一蛋白质氨基酸序列的密码。 central dogma ： 遗传信息只能从核酸传向蛋白质，而不能从蛋白质传向核酸。,基因组（Genome）,生物体的一套完整单倍体的遗传物质称为基因组。 人类基因组包含22条常染色体和X、Y两条性染色体上的遗传物质（核基因组）和线粒体的遗传物质（线粒体基因组）。,人类染色体的RxFISH图谱,基因,假基因,重复序列,人 类基因组7号染色体-TCR基因座的某50kb区域,基因片段,人类基因组各成分所占比例,真核生物基因组的结构特点,基因的编码序列所占比例远小于非编码序列。 高等真核生物基因组

6、含有大量的重复序列， 真核基因组中存在多基因家族和假基因。 大多基因具有可变剪接，80%的可变剪接会使蛋白质的序列发生改变。 基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞的基因组为二倍体。,基因家族（gene family）,由某一祖先基因经倍增和突变而产生的一组基因，它们的序列或编码产物有同源性。,基因家族的类型,核酸序列相同 核酸序列高度同源 编码产物具有同源功能区 编码产物具有小段保守基序 基因超家族 一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。家族成员的功能不一定相同。,全长16,569bp，含37个基因。 其中13个基因编码蛋白质， 其余24个编码rRN

7、A和tRNA。,人线粒体基因组图谱,基因组的维持,我们已经注意到，我们假设的特异的配对方式提示了遗传物质可能的复制机制。,第二部分,本章节主要内容,复制的一般特征,复制的机制,DNA的损伤和修复,基因组复制的一般特征（重点内容）,复制是半保留的 复制是双向的 在复制的生长点形成复制叉 复制起点由多个短重复序列组成 复制是半不连续的 复制是高保真的,DNA复制是半保留复制,DNA双螺旋中的每一条链都作为合成互补链的模板， 其结果就使得两条子代的双螺旋都和母本完全一致。,Meselson-Stahl实验,DNA复制是双向复制,DNA复制的生长点形成复制叉,复制起始点,复制的起始并非一个随机的过程，

8、它总是在DNA分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被称为复制起始点（Origin of Replication）。 环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着每一个复制叉要复制几千kb的DNA。 酿酒酵母约有300个复制起点，每一个起点对应40kb；而人类有20,000个起点，每个起点对应约150kb的DNA。,真核生物有多个复制起始点,酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真核生物染色体，它包含180个基因和 9 个复制起点。,从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域，它是一个独立复制单位。,复制子（replicon）,复制叉上DNA的合成是半不连续的,前导链,后随链,合成方向与解链方向相同

9、,合成方向与解链方向相反,两个原因造成了DNA的半不连续复制： DNA双链是反向平行的； DNA合成的方向只能是5-3。 因此， 在一条模板上，DNA能进行连续的合成，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新DNA链称为前导链（leading strand）。 在另一条模板上，DNA聚合酶与复制叉做反向运动，此模板指导合成的是后随链（lagging strand）。 在后随链上形成的新链DNA片段，称为冈崎片段（Okazaki fragment）。,基因组复制是高保真的,DNA聚合酶每添加105个核苷酸中，仅掺入一个不正确的核苷酸； 校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降低到10-7

10、； 错配修复系统使得最终的出错机率降低到10-10。 这相当于每复制1000个细菌基因组，仅出现一个错误的核苷酸。,BACK,基因组复制的机制,DNA复制的化学反应,DNA复制反应的底物是 dNTP和引物-模板连接处,反应由DNA聚合酶催化,所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构,DNA聚合酶能分辨正确与错误的碱基,DNA聚合酶能分辨dNTP与NTP,外切核酸酶活性校正新合成的DNA,影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基变成“错误”的互变异构体（亚氨基或烯醇基）； 错配的核苷酸激活3-5外切核酸酶活性； 错配核苷酸去除后，构象恢复，DNA聚合反应继续进行。,细胞中有多种DNA聚合酶,TLS,1

11、,Rev 1,TLS，体细胞高变,1,Pol ,相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）,1,Pol ,TLS,1,Pol ,体细胞高变（somatic hypermutation）,1,Pol ,减数分裂相关的DNA损伤修复,1,Pol ,TLS,1,Pol ,DNA交联损伤修复,1,Pol ,DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,4,Pol ,DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,23,Pol ,线粒体DNA复制和损伤修复,3,Pol ,碱基切除修复,1,Pol ,合成引物,4,Pol ,功能,亚基数目,真核生物,TLS（translesion synthesis）,3,Pol (Um

12、uC, UmuD),DNA损伤修复，穿越损伤合成（TLS）,1,Pol (Din B),染色体DNA复制,9,Pol 全酶,染色体DNA复制,3,Pol 核心酶,DNA损伤修复,1,Pol ,去除RNA引物，DNA损伤修复,1,Pol ,功能,亚基数目,原核生物（E. coli）,延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。 功能：切除引物，填补冈崎片段间的空隙、DNA损伤的修复。,DNA pol I （109kD） （重点内容）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA pol I,Klen

13、ow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA pol II（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活，但DNA突变率上升。 可能参与DNA损伤的修复。,2个核心酶（、 3种亚基） 1个复合物（、 6种亚基） 可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）,DNA聚合酶III的结构（重点内容）,全酶结构包括：,一次延伸达500000个核苷酸，催化速度达1000bp/s，有校对功能，是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,亚基有聚合酶活性 亚基有3-5校正核酸酶活性 亚基协助核心酶固定在DNA模板上 复合物连接两个核心酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶的

14、生物学特征 小结,所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构，形状类似于半闭合的右手； DNA聚合酶有两个活性中心，聚合酶活性中心和3-5外切核酸酶活性中心； DNA聚合酶的外切核酸酶活性是一种校正活性，可去除掺入DNA链的错误核苷酸； 细胞的DNA聚合酶由于执行的功能不同，而被高度特化。,复制叉上DNA的两条链同时合成,前面我们讨论了引物-模板接头处DNA的合成，然而在细胞内，DNA的双链是同时复制的。这就必须解决： 半不连续复制； RNA引物的合成和去除； 解开复制叉及相关的拓扑学问题。 这就需要多种蛋白质在复制叉上协助DNA聚合酶完成复制过程。,复制叉上DNA的合成是半不连续的,前导链,后随链

15、,合成方向与解链方向相同,合成方向与解链方向相反,RNA引物的合成与去除（重点）,所有的DNA聚合酶都不能从头合成DNA链，它们需要引物-模板接头作为底物； RNA聚合酶具有从头合成核苷酸链的能力； 细胞利用一种特殊的RNA聚合酶来启动复制：引物酶，能在单链DNA模板上合成5-10个核苷酸长度的短RNA引物，DNA聚合酶随后延伸这些引物。 大肠杆菌的引物酶是DnaG蛋白，真核生物的引物酶是DNA聚合酶的p48亚基。,原核与真核生物RNA引物的合成,原核与真核生物RNA引物的去除,RNase H可去除DNA:RNA杂交链中的RNA； DNA聚合酶（细菌中是DNA聚合酶 I，真核生物中目前认为是D

16、NA聚合酶 或 ）填补去除引物后留下的空隙（gap）； DNA连接酶连接两个相邻的核苷酸。,在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋,DNA聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项任务： 将DNA双螺旋分开以形成两条单链DNA模板； 保证复制前单链DNA保持伸直状态； 解决分开DNA双螺旋而引起的拓扑学问题。 （重点内容）,解螺旋酶解开DNA双螺旋,DNA解螺旋酶通常是六聚体蛋白，环绕着DNA，因此有很高的延伸能力； 解螺旋酶利用ATP的能量解开双螺旋； 所有解螺旋酶都有极性（polarity），即特异性地结合DNA双链中的一条。,细菌的解螺旋酶是DnaB蛋

17、白，它本身是六聚体，又与六个DnaC蛋白共同组成解螺旋复合物； 人类的解螺旋酶目前认为是Mcm2-7复合物，同样是六聚体； DnaB解螺旋方向为5-3，即结合后随链的模板。,单链结合蛋白使单链DNA稳定,拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋,DNA复制中的拓扑学难题： 在解链过程中伴随着DNA分子的旋转：双螺旋中每10bp形成一周； 以人的1号染色体为例，1号染色体长250Mb，复制时就必须旋转2500万次； 细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的方式解螺旋。,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶的作用机制（了解）,拓扑异构酶的作用机制,本图显示拓扑异构酶 II 除去由复制叉所产生的正超螺旋

18、： 通过“断裂-再连接”的方式，将未复制的DNA的一部分通过未复制区域的断裂点以消除正超螺旋。 该反应使连环数减少2，因此每复制20bp将会发生一次。,小结 复制叉酶扩大了DNA聚合酶的底物范围,DNA聚合酶本身只能作用于引物-模板连接处，但是引物酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了DNA聚合酶可能的底物范围： 引物酶使得DNA聚合酶能复制任何单链DNA； DNA解螺旋酶和拓扑异构酶使得DNA聚合酶能复制任何双链DNA。 没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。,E.coli 复制叉上DNA的合成,复制叉上的前导链和后随链同时合成； DNA聚合酶III全酶同时复制DNA的双链； 前导链迅速

19、复制。后随链进行不连续的合成； 引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和SSB蛋白协助DNA聚合酶III完成复制过程。,在复制叉上作用的全部蛋白质的总和称复制体（replisome）； 这些蛋白有独立的功能，当协同工作时，其活动通过蛋白质-蛋白质相互作用进行协调； 该机制的大肠杆菌中已知之甚详，而病毒与真核生物似乎也遵循相似规律； 复制叉相关蛋白的氨基酸序列在不同生物中有高度的同源性。,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,HO,5,3,3

20、,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,机体内的复制可以分为三个阶段,复制可以分为三个阶段：起始、延长和终止； 蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用指导起始过程； 真核基因组复制严格受细胞周期调控； 真核染色体的端粒有特殊的复制机制。,基因组的复制起始点有特殊的结构,基因组上存在能指导DNA复制起始的序列，称为复制器（replicator）； 称为起始子（initiator）的蛋白能特异性地识别复制器的序列，并激活复制的起始； 起

21、始子通过扭曲或解旋复制器附近的DNA区域并募集相关蛋白因子，而启动复制。,复制器的结构,起始子蛋白的功能,细菌的复制起始（了解）,大肠杆菌的复制器是oriC，起始子是DnaA。,大肠杆菌DNA复制起始的模型,细菌基因组的复制终止,细菌基因组复制由oriC开始，到ter终止； 复制完成还包括去除引物和连接冈崎片段； 拓扑异构酶解开套在一起的两个DNA分子。,RNA引物的去除,真核生物的复制起始,真核基因组复制仅发生在 S 期，在此期间，所有的DNA都必须且只能复制一次，这意味着所有的复制器都仅被利用一次； 真核生物的复制起始子是复制起点识别复合物（ORC），它募集相关蛋白因子，形成前复制复合体（

22、pre-RC）； 对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期内仅有一轮复制发生。,真核细胞的细胞周期,pre-RC的形成,ORC是起始子； Cdc6和Cdt1是解旋酶装载蛋白； Mcm2-7是解螺旋酶； pre-RC虽然只在G1期形成，但只在S期才激活。,对pre-RC的调控使得每个细胞周期只有一轮复制,细菌与真核生物的延长过程非常相似,真核复制叉的模型,真核生物存在末端复制问题（重点内容）,当冈崎片段合成的最后一个RNA引物被去除后，在染色体的末端将出现一段未复制的单链DNA，这将导致子代DNA分子被截短。,真核染色体特殊的端粒结构可弥补这一问题,结构特点：, 由末端单链DNA序列和蛋白质

23、构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短 序列。,端粒酶的结构,端粒延长机制（爬行模型）（掌握）,端粒酶对端粒3端的延长解决了末端复制,小结,基因组复制的起始受到复制器的特殊序列指导，复制器与起始子蛋白特异性的结合，并募集解螺旋酶等蛋白因子； 真核细胞中DNA的复制受到严格的调控，通过对pre-RC的形成和激活的控制，确保每个细胞周期染色体只复制一次； 结束DNA复制需要特殊的酶，对真核生物来说，端粒酶是保证染色体末端 不丢失的关键。,逆转录、D环与滚环复制,线粒体DNA按D环方式进行复制 噬菌体DNA按滚环方式复制 逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程,逆转录（Reverse

24、Transcription）（重点）,逆转录病毒基因组是单链RNA，它通过双链DNA中间体进行复制。 逆转录病毒生命周期中必不可少的一个步骤是：双链DNA插入宿主基因组内，并在插入位点产生长末端重复序列。 负责将RNA转变为DNA的酶是逆转录酶。,逆转录病毒的生活周期,逆转录病毒的基因组结构,逆转录酶有三种酶活性（重点内容）,RNA指导的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成DNA（合成的DNA称互补DNA或cDNA）。 DNA指导的DNA聚合酶活性：以DNA为模板合成DNA。 RNase H活性：去除DNA:RNA杂交链中的RNA部分。,逆转录研究的意义,拓展了中心法则。 拓展了20世纪初已注

25、意到的病毒致癌理论。 逆转录酶可以在试管内将mRNA转变为cDNA，成为分子生物学研究中重要的工具酶，逆转录是基因工程中获取基因的重要方法之一。,小 结,线粒体DNA按D环方式进行复制而噬菌体DNA按滚环方式复制。 逆转录病毒生命周期中有一段双链DNA时期。 逆转录酶有三种酶活性。 逆转录酶是基因工程中重要的工具酶。,BACK,DNA的可突变性与修复,遗传物质保持代代持续依赖于把突变概率维持在低水平上：生殖细胞的高突变率将摧毁物种；体细胞的高突变率将摧毁个体。 要使后代有很好的存活机会，DNA必须保持低的突变率。 但是，如果遗传物质具有绝对的忠实性，进化将失去动力，新物种（包括人类）都不可能出

26、现。 生命和生物多样性依赖于突变和突变修复之间的良好平衡。,DNA突变的来源,复制错误：由碱基的互变异构产生，发生频率为10-5。 化学和物理损伤：水解、脱氨基、烷化反应、氧化反应、碱基类似物和嵌入剂的插入、辐射伤害等。 转座子的转座。,细胞DNA损伤的类型,碱基丢失 碱基改变：点突变（转换、颠换），C脱氨基变为U、m5C脱氨基变为T、嘧啶二聚体 核苷酸插入或缺失：框移突变 DNA链断裂 DNA链共价交联,鸟嘌呤损伤的形式,UV导致嘧啶二聚体形成,烯醇式结构的5-BrU与G配对,吖啶类化合物可插入DNA双链导致双链结构改变,几个重要概念：点突变、转换、颠换 点突变：DNA序列上单个碱基的改变称

27、为点突变，可分为转换与颠换两种。 转换（transition）：同型碱基的取代称为转换，有4种形式。 颠换（transversion）：异型碱基的取代称为颠换，有8种形式。,转换,颠换,点突变,缺失,插入,倒位,重排,突变可能导致基因功能的改变 如果突变发生在基因的蛋白编码区，则可能引起蛋白质结构改变 如果突变发生在基因调控区，则可能引起蛋白质表达水平改变,当突变发生在蛋白质编码区,启动子突变：基因表达水平降低 剪接位点突变：错误的剪接 加尾信号突变：mRNA稳定性下降,当突变发生在转录调控序列,DNA损伤修复系统的类型（重点）,直接修复：嘧啶二聚体、O6-甲基鸟嘌呤 碱基切除修复：碱基损伤

28、核苷酸切除修复：嘧啶二聚体、碱基烷基化 错配修复：复制中的错误 重组修复：双链断裂 跨损伤DNA合成：嘧啶二聚体、无嘌呤位点,直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光复活修复系统,糖苷酶（glycosylases）识别、切除受损碱基，产生AP位点（apurinic or apyrimidinic site）。 AP内切酶在AP位点的5端切断磷酸二酯键。 AP外切酶再切割AP位点的3端。 DNA聚合酶填补产生的缺口。 最后DNA连接酶连接。,碱基切除系统修复切除受损碱基（了解）,碱基切除修复（base excision repair, BER）,对象：受损的碱基 修复系统：,E.coli碱基切除修复系统 切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶,胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶； 氧化的鸟嘌呤（oxoG）； 脱氨基的腺嘌呤； 开环碱基； 碳原子之间双键变成单键的碱基等。,DNA糖苷酶识别的异常碱基包括：,DNA聚合酶和连接酶以未损伤的DNA链为模板修补缺口。,核苷酸切除修复系统识别双螺旋变形（了解）,核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）系统识别DNA双螺旋形状的变形。,E.coli的NER主要由4种蛋白质组成： UvrA