waters色谱柱相关知识.ppt

1、液相色谱基础知识,色谱柱基础知识,对HPLC柱填料的了解,平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱填料的了解（二）,平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱填料的了解（三）,键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN,硅胶表面及键合相,键合相色谱柱,以硅胶为

2、基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,对HPLC柱填料的了解（四）,含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加） 高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C181917 Zorbax ODS1715.7 LiChrosorb RP-181

3、510.3 Symmetry C81212.5 Resolve C-181212.4 Ultrasphere ODS1111.3 Partisil ODS-31112.0 mBondpak C-1810 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱填料的了解(五),填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18, 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱填料的了解（六）,硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活

4、性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱填料的了解（七）,填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解,填料基质物理性质的影响,所有C18柱都是相同的吗? 填料基质的物理性质对色谱柱的影响 平均孔径及其分布影响被分析样品的分子量，大孔径的可分析高分子量样品 平均孔体积及其分布影响同孔径 含碳量影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长 填料的端基封口主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使碱性化合物拖尾 硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：K，高活性的K大 硅胶的

5、杂质含量更苛刻条件下的碱性化合物峰形,Waters色谱柱的内径,分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的色谱柱多为4.6mm内径。Waters传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm)细，因此： 相对灵敏度高 省溶剂，可用相对较低的流速 同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显) 注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解,理论塔板数(N),容量因子(K),选择性系数(),其影响因素有 N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高 ：受填料表面化学性质对色谱柱的影响, 不同键合相

6、对不同种类样品分离不同 K：受键合相表面含碳量的影响,含碳量高 时保留时间长,在同样情况下保留行为也有差异,因此： 需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解 需要不同品牌，即各个因素有较大差异的色谱柱，以得到更多种选择性 Waters拥有众多不同品牌的色谱柱，目的就是：供不同应用的要求 用不同品牌的色谱柱时，色谱方法有时可能需要重新开发,Waters各种硅胶基质的色谱柱,Waters不同品牌的色谱柱,m-BondaPak 文献背景强, 是工业标准 平均孔径125，10mm高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性 Nova-Pak 平均孔径60，4mm高韧度低活性球形硅胶 低酸性

7、，高疏水性, 极好的端基封口 有利于小分子物质的分析,Waters不同品牌的色谱柱,Resolve 平均孔径90，5/10 mm低活性硅胶 非常高的疏水性, 无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离 Delta-Pak 有100和300两种孔径，5/15 mm硅胶 中到高的疏水性，端基封口 适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry 高纯度硅胶：Fe, Al, Mg等均10ppm 孔径100，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 对称峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,由

8、于拖尾引起的灵敏度差异,他莫昔芬 0.25 g/mL,信噪比 11.0 6.5,AU,AU,5.00,10.00,Minutes,Conventional C18,T = 1.58,Waters,21,379,峰面积回收率,由于拖尾引起的积分误差,超越极限：全新Xterra色谱柱,集硅胶与聚合物基质填料的优点为一体,突破常规高效色谱柱的极限 高效、高速分离 不仅能够使用极小粒径的填料以进行高分辨及快速分析，而且允许在高温下进行分离 峰形优异 -对碱性化合物尤其如此 pH范围可与聚合物基质色谱柱相比 pH范围1-12 极佳的稳定性 即使在高温或极端pH条件下仍可维持长寿命,峰形比较：XTerra

9、 MS C18 与普通C18,Alden, Iraneta,宽 pH 范围,在pH 1-12范围内保持稳定 使pH 成为改变选择性的有力工具 使可在非离子状态下进行分析 碱性物质的稳定保留,加速色谱柱寿命试验： (pH 10 ，50 C),寿命 (小时),Xterra: 快梯度分析,Waters特殊应用的色谱柱(1),糖及其它碳水化合物的分析 离子交换柱(钙基/Ca) 用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。 柱温90，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求

10、较高，要求用户另置超纯水系统。 氨基类型柱 分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10。用途较为广泛，主要用于食品中糖的分析。 反相类型柱 硅胶类型柱 体积排除(凝胶/GPC)类型柱,Waters特殊应用的色谱柱(2),食品中常见有机物的分析 游离脂肪酸(Free Fatty Acid)分析 甘油三酯及胆甾醇(俗称胆固醇)的分析 NovaPak C18 胆甾醇及未皂化的油中的抗氧剂的分析 Styragel HR 100A及500A柱有效地分离。 离子排斥类型色谱柱，用于有机酸，醇和碳水化合物类的分析，适合于分析单糖类、有机酸或糖酸 离子排斥及反相混合类型的色谱柱，可测定葡萄酒、啤酒或其他

11、饮料中的乙醇及有机酸的种类及含量，以确定其香型,Waters特殊应用的色谱柱(3),Waters生命科学专用柱(1) 蛋白，多肽的分析和提纯 Protein-Pak系列凝胶柱 Protein-Pak系列离子交换柱 弱阴离子/ DEAE弱阳离子/ CM 强阴离子/ Q 强阳离子/ SP 疏水回受柱 亲合色谱柱 反相柱 DNA分析，同蛋白分析相近，但有些专用柱,Waters特殊应用的色谱柱(4),Waters生命科学专用柱(2) 糖蛋白的寡聚糖分析及纯化 离子交换柱(酸性)，Glyco-Pak DEAE 分配柱(中性)，Glyco-Pak N (7.8300mm) Carbohydrate Ana

12、lysis 儿茶酚胺分析柱 Resolve C18 (传统方法)、Symmetry C8 氨基酸分析柱 离子交换柱 反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法,液相色谱实用技术（二）,色谱柱的使用及保养,色谱柱与仪器的联接,不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造成： 色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏 解决办法 自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth的长度可调。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。,

13、色谱柱的联接,各种锥箍和管路接头长度示意图:,色谱柱的联接,Stop_depth长度不合适造成柱前死体积,色谱柱的联接,锥箍锥度不合适造成渗漏:,Waters色谱柱的联接,Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出的不锈钢管长度不同 其长度被称为：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司的其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090

14、英寸,测柱效-良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽,测柱效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定 以下是Waters反相C18柱的测定方法: 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮 进样量5l 检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： Ws 方法 Wtan16切线法 Wh5.54

15、半峰高 W3s9 3s W4s16 4s W5s25 5s,Inject,Inject,用“切线”法计算柱效,不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来,Good Column,Inject,Inject,用“5”法计算柱效,色谱柱的正确使用及操作,流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,正确使用色谱柱（一）,样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用,正确使用色谱柱（二）,流动相方面 除去微粒

16、纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱,在线过滤器,In-Line Filter，部件号 WAT084560 防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析） 可更换的消耗品 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换

17、垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs),保护柱,可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类 普通自装填料的保护柱 Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 Guard-Pak预装保护柱 Waters的部件号，WAT088141 有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，会引起柱效降低,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍

18、柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,色谱柱的存放,存放前的处理 除去杂质、缓冲盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干涸 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度,色谱柱的故障与异常,柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低,柱压过高,为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长,柱效低,为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成柱床产生裂缝 柱

19、床收缩或干涸,重复性差、回收率低,实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附,色谱柱以外的因素（一）,“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 系统连接问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大,色谱柱以外的因素（二）,柱压过高，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误?,色谱柱以外的因素（三）,实验的重复

20、性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足,简单的判别方法,高的柱反压是否伴随着 保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏? 测量色谱系统的谱带展宽 典型的分析系统应远小于 100 微升 如大于此数应检查仪器系统,测量色谱系统的谱带展宽,卸下色谱柱，用UNION(两通)代替之 按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升 用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W 仪器参数 流速1.0 ml/min 纸速20 cm/min (用记录仪时，接检测器10mV档) 检测器灵敏度0.5-1.0

21、AUFS (用记录仪时) 检测器时间常数小于0.2 谱带展宽（ml）=1000W（cm）/20（记录仪）=1000W（min） （工作站）,流动相及样品的预处理,液相色谱实用技术（三）,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相对的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 防止细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热 简单，如同抽真空一起

22、使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 在线脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于保护色谱柱及仪器,样品预处理的重要性,占样品分析时间的比例最大 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析消耗总成本的比重最大 消耗大量的溶剂及其它化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,样品预处理的

23、过程,理想的样品处理方法,选择性吸附 去除干扰物 在广泛极性范围内，对酸性、碱性及中性物质皆可获得高而重现性的回收率 容易实现自动化以获得高样品吞吐量 简单方法 容易使用，耐受性好 快速、经济,样品预处理常用的方法,高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Oasis和Sep-Pak固相提取小柱 其他,去除微粒,过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5 m)/无机(0.45 m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000rpm,超滤,机理 超滤是一种基于分子量分离的技术

24、目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA,样品衍生,提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,6-氨基喹啉,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提 Oasis小柱 Sep-Pak小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取

25、技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上 缩短样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性,全新的固相提取小柱 Oasis,HLB亲水-亲脂平衡共聚物,“亲水” 使填料具有水可浸润性质 降低与水的接触角,“亲脂” 提供对被分析物质的反相保留能力,特征一，水湿性 优势 即使小柱在固相提取过程中干枯，也能吸附被分析物质 益处 即使小柱在固相提取过程中干枯，也能获得高回收率(85%) 提取板及小柱可获得一致的回收率

26、(RSDs5%) 容易使用,Oasis HLB 固相提取小柱,C18与Oasis HLB 吸附剂 浸润能力的比较,H,L,H,L,H,L,H,L,H,L,H,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,HLB,H = 亲水单元 L = 亲脂单元,C18,特征二，通用型吸附剂 优势: 在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物 样品不会穿透小柱 益处: 对极性化合物可获得较高回收率 使用同一方法，提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率 一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程,Oasis HLB固相提取小柱,结果: 通用型吸附剂,Oasis小柱的使用方法,平衡/活化小柱,1mL甲

27、醇/1mL水,上样,可上200 mL样品,清洗,1mL5%甲醇/水,洗脱,1mL甲醇,挥发并用流动相重组,样品制备,将样品用水稀释,准备进样,Oasis HLB ：优化的提取方法,Oasis HLB 固相提取小柱,特征三，重现性 Oasis HLB吸附剂填料在Waters ISO 9002-认可的工厂中生产 确保重现性. 优势 每批吸附剂进行严格的质量控制，建立SPE填料重现性的新标准 益处: 每盒产品附带合格证书 不同批次具有重现的回收率,Oasis 不同批次间重现性,Batch A,Batch B,Batch C,0.96% 1.21% 2.02% 3.66% 2.40% 3.06% 3.

28、67% RS,D,0,20,40,60,80,100,% Recovery,Procainamide,Ranitidine,Acetaminophen,Propranolol,DP-phthalate,Doxepin,b,-Methasone Valerate,Oasis HLB -应用,各种药物提取，尤其是生理体液中的药物， 如血浆、尿液中的药物等 天然产物提取 农业化学应用，如提取除草剂、杀虫剂等 环境化学应用，如提取多环芳烃等,色谱图常见问题,色谱图常见问题主要有两类: 色谱峰峰形异常问题 例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等 色谱峰保留时间问题 保留时间不稳定等,色谱图常见问题分析

29、(一),色谱峰峰形异常问题: 色谱图中未出峰: 进样问题:未进样或样品分解 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 检测器设置不正确,或检测器有问题 一个或几个峰是负峰 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 所有的峰均为负峰: 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒 光学装置尚未达到平衡 所有的峰都是宽峰 系统未平衡或未达到化学平衡 溶样的溶剂比流动相强很多 色谱柱类型或尺寸不正确 色谱柱或保护柱被污染或降级 温度变化对色谱柱的影响,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:

30、 较早洗脱的峰呈宽峰 进样体积过大或样品浓度太高 进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适 在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞 管路问题:内径不对或切管不正确 管路连接问题:接头或锥箍不正确 检测器时间常数不正确,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 峰比预想的要小 样品粘度过大 进样器有问题或进样体积有误 检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确 检测器输出未置零 用了不正确的检测器输出信号 检测池被污染 检测器的灯可能有问题,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口堵塞 保护柱或色谱柱污染或失效 前

31、伸峰 进样量或样品浓度过大 溶样的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题: 拖尾峰 保护柱或色谱柱问题:污染或失效 进样问题 检测器时间常数不正确 平头峰 检测器设置不正确 进样体积太大或样品浓度太高,色谱峰保留时间问题: 保留时间飘忽不定(各次运行之间) 系统不稳定或未达化学平衡 泵压力不稳(泵头里有气泡) 进样体积过大或样品浓度过大 温度波动 流动相混合不均匀 色谱柱被污染,色谱图常见问题分析(二),色谱峰保留时间问题: 保留时间增加或减少(各次运行之间) 系统不稳定或化学平衡不足 泵流速变化 温度变化 色谱柱污染,柱效下降 流动相被污染 溶剂入口过滤器堵或管路堵塞 系统渗漏,色谱图常见问题分析(二)(续),色谱图常见问题分析(二)(续),色谱峰保留时间问题: 保留时间改变到一个新的恒定值 流动相不正确或其组成不正确 泵流速变化 实际输液的流速不正确(泵失灵或故障) 环境温度变化