层析分离纯化技术-课件.ppt

1、1,层析分离纯化技术,2001.11.28 Shanghai Pudong,2,蛋白质纯化策略,融合蛋白质,非融合蛋白质,表达,简单纯化,一步 亲和层析,90 - 97 % 纯度,更高纯度,三步纯化策略,粗提 中度纯化 精细纯化,多步纯化,3,简易纯化选择,载体和标记纯化 pGEX谷胱甘肽 S-转移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap, Glutathione Sepharose Fast Flow PQE6 x 组氨酸His MicroSpin Purification Module pETHisTrap, HiTrap Chelating,

2、6 x组氨酸Chelating Sepharose Fast Flow pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow,4,GST 融合蛋白的纯化,GST,重组蛋白,酶切位点 Factor Xa:Mr 17-20 000 / 28-30 000 Thrombin: Mr 37 000 PreScission Protease:Mr 46 000,Glutathione Sepharose,Mr 26 000,1

3、0C,5,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料一次可纯化 GST注意融合蛋白的量 GST MicroSpin 400 g立即可用, 预装柱, Purification Module 缓冲液和试剂 和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量(一次处理 48 样品) GSTrap 1 ml10 - 12 mg立即可用, 预装柱 GSTrap 5 ml50 - 60 mg立即可用, 预装柱 Glutathione Sepharose 4B8 mg / ml可自行装柱 Glutathione Sepharose 410 -12 mg / ml可自行装柱，使用层析系统快速纯化

4、，Fast Flow 适合放大,6,GST MicroSpin Purification Module,立即可用, 50 预装柱含缓冲液和所需试剂 可纯化每柱 400 g, 体积达400 l 样品,适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化,7,GSTrap 柱,20 分钟内 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统 添加剂兼容,适合快速和重复性高的要求,8,GSTrap,结合缓冲液平衡,加样后用结合缓冲液冲洗,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱,收集组份,3 min,5-15 min,2 min,9,GSTrap,SDS PAGE anal

5、ysis,柱:GSTrap 1 ml 样品:8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 结合缓冲液:PBS, pH 7.3 洗脱缓冲液50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 还原谷胱甘肽 流速:1 ml/min 层析 步骤:4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) 系统:KTAexplorer 10,1:低分子量标记 (LMW) Calibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech 2:胞浆萃取液, 1 g /10 ml 3:洗脱GST 融合

6、蛋白,10,Glutathione Sepharose Fast Flow,适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大,每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 装在 XK 空柱中和 KTA 平台纯化系统连接使用 高流速 兼容尿素，盐酸胍等,11,GST 融合蛋白的检测,检测方法注意 GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒适合筛选表达系统和层析组份当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用 GST 酶测定检测模组快速测定；适合筛选用途 功能测定可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白的活性，但可能需要自行设计和优化,12,GST融合蛋白的检测,检测方法注意 使用抗-GST 抗

7、体和高度特异, 只检测 GST 融合蛋白ECL 检测系统的使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度需要更高灵敏度时使用 ECL Plus. SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 纯度讯息.考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.,13,GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒,快速酶测定 每块板可检测 50 样品 适合筛选表达系统和层析组份,14,(His)6 融合蛋白的纯化和检测,重组蛋白,His,His,His,Ni2+,His,His,His,His

8、,Ni2+,Ni2+,Ni2+,15,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料一次可纯化 注意融合蛋白的量His MicroSpin 100 g立即可用, 预装柱,Purification Module 缓冲液和试剂 和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量(一次处理 48 样品) HiTrap Chelating 1 ml 12 mg立即可用, 预装柱 HisTrap Kit 12 mg/柱含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液 HiTrap Chelating 5 ml 60 mg立即可用, 预装柱 Chelating Sepharose Fast Flow 12 m

9、g/ml 自行装填到空柱和放大用,16,His MicroSpin 纯化模组,立即可用, 50 预装柱连缓冲液和试剂 每柱可纯化达 100 g, 体积达 400 l 样品,适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化,17,HisTrap Kit,每根 HiTrap Chelating 金属螯合柱可在少於 25 分钟中纯化 12 mg 融合蛋白 包含所需浓缩缓冲液和工具 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统 添加剂兼容,快速，重复性好和容易使用,18,HiTrap Chelating,准备柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗,加样 用平衡缓冲液冲洗柱子,废液,收集,用洗脱缓冲液

10、洗脱融合蛋白,收集组份,3 min,5-15 min,2 min,用平衡缓冲液平衡柱子,废液,3 min,19,HiTrap Chelating,SDS PAGE,样品:5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 结合缓冲液:1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脱缓冲液:1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4 流速: 2 ml/min, 312 cm/h 结果:洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg,1:低分子量标记 (LM

11、W) 2:样品稀释 1:20 3:穿透稀释 1:10 4:冲洗液 5:洗脱 GST-(His)6,稀释 1:20 6:洗脱 GST-(His)6,稀释 1:10 7:GST 标准品, 0.5 mg/ml 8:LMW,20,Chelating Sepharose Fast Flow,适合自行装柱和放大,每毫升填料可纯化高达 12 mg 融合蛋白 装在 XK 空柱中和 KTA 平台纯化系统连接使用 高流速 兼容添加剂,21,检测 (His)6 融合蛋白,检测方法注意 ELISA 测定标记 IgG高特异性，只检测 (His)6 融合蛋白 功能测定可有效评估纯化出来的 (His)6 融合蛋白是否具备活

12、性 不一定能买到可能需要自行设计和优化,22,检测 (His)6 融合蛋白,检测方法注意 使用抗-His 抗体和高度特异, 只检测 (His) 6 融合蛋白ECL 检测系统的使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏度需要更高灵敏度时使用 ECL Plus. SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 纯度讯息.考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.,23,其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (1/3),如果有对应配基，使用亲和层析 一步纯化 高灵敏度 高载量,24,其他

13、融合 或 非融合蛋白的纯化 (2/3),立即可用的 HiTrap 柱,应用 预装柱抗体分离 所有来源的 IgG，其亚族，和片断 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A 包括人源IgG3 ，小鼠 IgG1和大鼠 IgGHiTrap Protein G 的 IgG，其亚族，和片断 腹水，血请，体液，和细胞培养液的 MAbTrap GII (HiTrap Protein G column (1 ml), 单克隆和多克隆 IgG 工具, 浓缩缓冲液) 鸡蛋请的 IgY HiTrap IgY 单克隆和人源 IgMHiTrap IgM,25,其他融合 或 非融合蛋白的纯化

14、 (3/3),立即可用的 HiTrap 柱,应用：基团特异填料 预装柱 白蛋百, 多种核酸依赖酶, HiTrap Blue 凝血因子, DNA 结合蛋白, a2-巨球蛋白 外露氨基酸: His (Cys, Trp) HiTrap Chelating的蛋白和多肽 e.g. a2-巨球蛋白和干扰素 生物素和含生物素物质HiTrap Streptavidin 凝血因子, 脂蛋白酶，HiTrap Heparin 胆固醇受体, 激素, DNA结合蛋白, 干扰素,蛋白质合成因子 活化好的亲和柱自行挂上配基 HiTrap NHS-activated 偶连一级氨基,26,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,准备配

15、基 (e.g. 抗体) 准备柱子 (e.g. NHS-activated HiTrap) 现成方法 优化结合和洗脱条件 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统操作的 HiTrap 小柱,制作一支特异亲和纯化柱,27,其他融合 或 非融合蛋白的检测,生物活性,Native PAGE IEFMS,分子大小 蛋白质酶切,SDS-PAGE 免疫印迹 MS,N-端测序,聚合物 差异性,pH 稳定性, 离子强度, 蛋白质和 清洁剂浓度,结构变异 N-端差异,28,去处小分子,纯化后 (His)6 融合蛋白的咪唑 酶切后的 GST 或 His 标记 多余的盐/尿素/盐酸胍 用 HiTrap Desalting

16、 将样品转移到另一种缓冲液中，e.g. 储存用或改变 pH,29,交换缓冲液和去盐的柱子,快速有效 高处理量 去盐, 交换缓冲液, 去掉低分子量物质,柱子样品体积样品洗脱体积 MicroSpin G-25 0.1-0.15 ml0.1-0.15 ml HiTrap Desalting0.25-1.5 ml1.0-2.0 ml HiPrep 26/10 Desalting2.5-15 ml7.5-20 ml,30,交换缓冲液和去盐的柱子,HiTrap Desalting,咪唑在盐峰中一并被去除,(His)6 融合蛋白,31,选择纯化设备,纯化需要MicroSpinSyringe +KTA 系统

17、+PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns 快速，高处理量筛选 (GST or (His)6 融合蛋白) 非常快速，一步纯化 (适合大部分融合蛋白) 一步纯化 (适合大部分融合蛋白) 优化以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性 ,32,选择纯化设备,多步纯化 (非融合性蛋白或需要更高纯度) 工艺开发和优化 法规需要 e.g. GLP/GMP 纯化工艺放大 转移工艺到更大规模,使用 KTAFPLC 或 KTAexplorer 系统:,33,大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融合蛋白的扩增，纯化和复性,详细步骤,34,过程,细胞培养,收

18、获细胞,细胞破碎,离心 5 - 10 000g,沉淀物,冲洗和离心,分离包涵体,HiTrap Chelating Ni2+ 纯化和复性,溶解,35,每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4C下高速离心 10 分钟 重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在+4C下高速离心 10 分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物,包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离,2 M UREA,20 mM Tris HCl,2% Triton X100,0.5 M NaCl,

19、36,溶解和准备样品,重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.): 20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8,在室温等 30-60 分钟 在+4C 离心 15 分钟 用 0.22 m 或 0.45 m 濾膜过滤,37,准备 HiTrap Chelating 柱,冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tris -HCl, 5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱,最多 5 分钟,3

20、8,纯化和复性,稀释样品, 用 10 ml 结合缓冲液洗柱，5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, pH 8.0上样，并以 20 mM咪唑, 6 M 尿素 pH 8.0 缓冲液洗柱 复性 线性梯度： 6 to 0 M 尿素 最少 30 柱体积流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积 纯化和洗脱 线性梯度: 20 mM - 500 mM 咪唑10 - 20柱体积,用 HiTrap Desalting 交换缓冲液去除咪唑,39,组份分析,1: LMW 2: 样品 3-6:盐酸胍冲洗物 7, 8: 尿素冲洗物,1: LMW 2-6:组份 38-42 7,8:

21、组份 48, 49,Superdex 75 HR 10/30,SDS PAGE PhastGel Gradient 1015 样品稀释前处理:用 15% SDS, 30% 2-巯基乙醇 +10 mM Tris+1 mM EDTA稀释1:5,HiTrap Chelating 1 ml,Superdex 75 HR 10/30,40,多维蛋白质纯化,41,高效纯化策略,粗提,纯化,精细纯化,载量,速度,分辩率,回收率,42,减少处理步骤,得率 (%),95% / 步,90% / 步,85% / 步,80% / 步,75% / 步,0,20,40,60,80,100,1,2,3,4,5,6,7,8,

22、步骤,43,准备工作,考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济,蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点,44,pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变,滴定曲线,不同 pH 下的分离情况,2,1,+,-,45,pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变,流动相的 pH 选择性,46,样品准备,考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品,47,三步纯化策略,48,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,层析填料的 颗粒大小,中度纯化,49,三步纯化策略

23、,步骤,粗提,精细纯化,流速,中度纯化,50,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,分辩率,中度纯化,51,粗提,目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,52,粗提: 离子交换填料,预装柱 20ml颗粒大小流速 HiPrep 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/min HiPrep 16/10 DEAE & CM 90 m 10 ml/min,Sepharose Big Beads,STREAMLINE,Sepharose Fast Flow,53,粗提: 疏水层析填料,高载

24、量 高流速,HiPrep 16/10 Phenyl (高 & 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 Octyl,HiTrap HIC 选择试剂盒,放大,54,中度纯化,目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,HiLoad 离子交换和疏水层析预装柱,分辩率,快速,回收率,载量,55,中度纯化: 离子交换填料,Sepharose HP 34 m,Q & SP,150 cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE 30 m,Sepharose High Performance,SOURCE 30,Q & S,1 800 cm/hr,

25、聚苯乙烯/二乙烯基苯,小包装,56,中度纯化:疏水层析填料,Sepharose HP 34 m,苯基,300 cm/hr,小包装和预装柱,57,回收率,载量,精细纯化,目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析,分辩率,速度,58,精细纯化: 凝胶过滤填料,Superdex Peptide,Superdex 200,Superdex 75,Mr 3 000 - 70 000,Mr 100 - 7 000,Mr 10 000 - 600 000,分离分子量大小 (球状蛋白质),102 103 104 105 106,用 prep

26、grade (34 m) 放大,HR 预装柱 (13 m),59,精细纯化: 凝胶过滤填料,Superdex 30 pg,Superdex 200 pg,Superdex 75,分离分子量大小 (球状蛋白质),102 103 104 105 106,Prep Grade (34 m),有HiLoad 预装柱和小包装填料,Mr 100 - 7 000,Mr 3 000 - 70 000,Mr 10 000 - 600 000,60,精细纯化:离子交换填料,Mono Beads Q & S,10 m: Mono Q & S, 25 mg 上样载量,3 m: Mini Q & S,Mini Bead

27、s Q & S, 2 mg上样载量,61,精细纯化:离子交换和疏水层析填料,RESOURCE 15 m,Q, S, Phenyl, Ether, Isopropyl,1 ml 预装柱流速高达 10 ml/min,RESOURCE HIC Test Kit,62,精细纯化:反相层析填料,Sephasil,RPC,SOURCE RPC,硅胶,3 m,C2/C18,聚苯乙烯/二乙烯基苯,120 : 肽类,C4, C8, C18,5 and 12 m,硅胶,100 : 肽类 300 : 蛋白质,pH 1 - 12 (14),肽类,5, 15 and 30 m,63,Source,30 m,15 m,5

28、 m,离子交换/疏水层析/反相层析,反相层析,离子交换/反相层析,64,适用於三步纯化策略的层析技术,蛋白质性质层析技术 净电荷离子交换(IEX) 大小凝胶过滤(GF) 疏水性疏水层析(HIC), 反相层析(RPC) 生物辩识 (配基特异性)亲和层析(AC) 配基特异性，净电荷, 扩张柱床吸附技术 (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC,65,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,主要特色,粗提,中度纯化,精细纯化,IEX,高分辨率 高载量 快速,HIC,分辨率好 载量一般 快速,AC,高分辨率 高载量 快速,GF,高分辨率,RPC,高分辨率,66,适用於三步纯化策略的层析技术,层

29、析技术,样品起始状态,样品结束状态,IEX,低离子强度,高离子强度或 pH 改变,样品体积不受限制,样品被浓缩,HIC,高离子强度,低离子强度,样品被浓缩,AC,特异性结合,特异性洗脱条件,样品体积不受限制,样品被浓缩,GF,样品体积受限制,交换缓冲液,(5% 总柱体积),流速受限制,样品被稀释,RPC,需要有机溶剂,在有机溶剂中，或会损失,生物活性,样品体积不受限制,67,纯化工艺中不同层析技术的衔接,一般准则: 结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g. IEX, HIC and GF) 减少不同层析技术间的样品处理(e.g. 浓缩, 交换缓冲液) 尽量简单,68,衔接

30、层析技术时注意事项,层析技术,结束情况,起始条件,小量样品,GF,低离子强度,IEX,高离子强度或 pH 改变,高离子强度,HIC,低离子强度,特异性结合条件,AC,特异性洗脱条件,样品稀释 交换缓冲液 (如果需要),69,合理衔接不同层析技术,低溶解度的蛋白质,SDS,萃取,SDS,萃取,溶解试剂,(尿素, 乙二醇,非离子性清洁剂),GF,(在非离子性清洁剂中),HIC,HIC,GF,GF,70,合理衔接不同层析技术,粗样或样品含高盐,GF,脱盐,GF,脱盐,GF,脱盐,AC,IEX,HIC,或者需要稀释,IEX,IEX,HIC,GF,或,RPC,GF,或,RPC,GF,GF,样品澄清,粗提

31、,中度纯化,精细纯化,71,合理衔接不同层析技术,样品非常澄清或很稀,AC,IEX,IEX,沉淀,(e.g. 在高离子强度下),HIC,重新溶解,GF,作含高盐样品处理,粗提,中度纯化,精细纯化,GF,或,RPC,GF,或,RPC,72,一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定 Purification of a labile, oxygen-sensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination,一个可溶性，非融合蛋白质的多维纯化,去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶 Deacetoxycephalospori

32、n C synthase (DAOCS),Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund, Amersham Pharmacia Biotech 联合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield, Oxford Centre for Molecular Sciences, Oxford, UK Inger Andersson, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden,73,DAOCS去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶,D-AA = d-(D-a-amino

33、adipoyl),主要参与在头孢菌素和来自链丝菌 clavuligerus 中青霉素 N 的头霉菌素的生物合成 属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶,青霉素 N,去乙酰氧化头孢菌素 C,74,DAOCS - 纯化策略,纯化目标,DAOCS定性,准备样品,精细纯化,粗提,快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting),中度纯化,快速探索填料 (scouting) 快速探索梯度 (scouting),75,DAOCS - 纯化,目标 得到 5-10 mg DAOCS，纯度足够进行结晶和 X-射线绕射分析 在一个工作天内完成整个纯化流程 工艺可放大最少 10 倍.,76,结晶纯需

34、要,大分子均一性- 其他, 污染性蛋白质 序列均一性- 蛋白水解片段- 转译后修饰 - 其他修饰 (氧化等) 构象均一性- 聚合- 失活,要拿到高纯度结晶，必须 使用纯和均匀的蛋白质,77,DAOCS - 定性,参数 等电点 分子量 盐稳定性 一般稳定性,对纯化设计的影响 在粗提时使用中性 pH 进行阴离子交换层析 用 Superdex 75 prep grade 凝胶过滤技术进行精细纯化 可以使用疏水层析 在缓冲液中加 DTT 工艺设计重点缩短整体纯化时间,数值 4.8 34 500 2 M (NH4)2SO4 容易氧化,78,DAOCS - 一般准则,在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸残基保持还原状态 加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性 用 SDS PAGE 检查每一个组份中 DAOCS 利用酶测定法测量生物活性,79,准备样品,悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中 超声震荡破碎细胞 DNA 沉淀 利用离心沉淀,来源:从 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增,80,选择粗提的层析技术,阴离子交换: 快速, 浓缩 样品处理最简单 分离基础: 电荷 因为 DACOS 的酸性 pI 和不稳定性，所以缓冲液选择中性 pH,81,粗提 - 在 KTAFPLC 上优化梯度,层析柱:HiPrep 16/10 Q XL 系统:KTAF