DIGE实验步骤.ppt

1、DIGE实验步骤,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,DIGE实验步骤,一、DIGE实验原理及流程 二、DIGE双向电泳样本制备 三、DIGE双向电泳样本标记 四、第一向电泳IEF电泳 五、胶条平衡 五、第二向电泳SDS-PAGE电泳 六、图片扫描 七、DIGE荧光图片分析,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,一、DIGE实验原理,DIGE 双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)，是在传统双向电泳的基础上发展而来的新型蛋白质组学定量技术，其分离

2、蛋白质混合的原理与双向电泳是一致的，主要利用蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质混合物，同时应用荧光染料的灵敏度及内标的使用等技术，使其在定量蛋白质组学的研究中效果明显优于传统双向电泳。 DIGE使用的荧光染料有Cy2, Cy3和Cy5，它们能与蛋白质的赖氨酸侧链氨基反应而使蛋白质被标记，被标记蛋白质的等电点和分子量几乎不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，不同凝胶之间可以通过cy2内标匹配，消除凝胶之间的差异，蛋白质表达量的变化则通过cy3和cy5不同荧光的强度来体现。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,一、DIGE实验流程图（最小标记法）,DIGE荧光定量方

3、法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。3、蛋白质定量分析：ImageMaster 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。,二、DIGE双向电泳样本制备动物样本,（1）将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。 （2）在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集） 粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min

4、，离心20min，收集上清液。 （3）超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。 （4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (5)在干燥后的蛋白质团块中加入200uL LB，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，80W，0.8秒开，0.8秒关，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4，12000r/min，离心

5、20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。纯化好的蛋白质团块需用LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是8.5，需调节PH值。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,二、DIGE双向电泳样本制备植物样本,（1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。 （2）在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，

6、下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。 （3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。 （4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。 （5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。,辉骏生物： 免费服务热线：400-6

7、99-1663,（6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (7)在干燥后的蛋白质团块中加入200uL LB，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，80W，0.8秒开，0.8秒关，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。纯化好的蛋白质团块需用

8、LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是8.5，需调节PH值。,二、DIGE双向电泳样本制备植物样本,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,Alklysis buffer(LB),Phenol extraction buffer,醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol,用甲醇配制0.1M的醋酸铵,二、DIGE双向电泳样本制备,三、DIGE双向电泳样本标记,1: 蛋白质定量 一般使浓度需保证在5-10ug/ul。 2：染料溶解 DIGE试剂盒放于-20保存，染料使用前需于室温下复温10min以上，复完温后的染料10000r/min离心8min，加入

9、相应量的DMF溶解，配制染料储液，使其浓度为1nmol/uL。用移液器吸取相应量的DMF，打到装染料的离心管管壁上，再离心将DMF甩至管底，震荡8min后离心即可。 3：标记蛋白 染料的工作液浓度为400pmol/uL，将储液和DMF按照1：1.5的比例混合即可配成工作液，标记时每50ug蛋白需要使用400 pmol染料。吸取各个样本蛋白50ug至0.6mLEP管中，再分别吸取等量的各个样本2混合成一管（总量以为50ug)，实验组和对照组蛋白按照实验设计加入相应的Cy3和Cy5染料，每个样加入1uL染料，混合样本按照蛋白总量加入相应量的Cy2染料。 加入时先吸取所需的染料，打在各蛋白样本EP管

10、的管壁上，统一离心甩至管底，然后统一震荡1min，立于冰上避光反应30min，Cy3和Cy5可分别作为一组进行操作，以保证各个样本有相同的标记时间。标记反应进行30min后各管加入1uL 10 mM Lysine，立于冰上10min，终止标记反应。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,四、第一向电泳IEF电泳,1：IEF上样蛋白质准备 每根胶条的上样液的成分为：三管标记的蛋白质（cy2,cy3,cy5)、1%DTT、1%IPG Buffer、1溴酚蓝、LB调制最终体积至460L。将样品溶液混合均匀后，4 12000r/min，离心20min，吸取上清液450L进行泡胀。 2：上

11、样 取出水化盘，在底下铺上白色纸巾（方便观察胶条泡胀情况），调节水平备用。从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450L样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160L，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20L左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满。调节室内温度为20，让胶条泡胀过夜（1012h）， 3：等点聚焦（IEF) 等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 0:45Hr S2 stp 700V 0:45Hr S3 stp 1500V 1:30Hr S4 grd 9000V 3:

12、00Hr S5 stp 9000V 4:00Hr 整个聚焦过程所用总电压：52KVh 4：胶条保存 跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20保存。如果需要运输，则要用冰完全包埋平衡管保温。,五、胶条平衡,1：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS-PAGE电泳。 2：实验步骤 （1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水。 （2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （3）：SD

13、S平衡液加入250mM IAA混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （4） SDS 平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)， 6M Urea (FW 60.06)，30%(v/v) Glycerol (87% v/v)，2% (w/v) SDS (FW 288.38)，0.002%(w/v) Bromophenol blue。 注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好.,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,六、第二向电泳SDS-PAGE电泳,1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGE胶：,2、配制12.5%SDS-PAGE

14、凝胶：,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,30%T,2.6%C Monomer stock solution：,4 Resolving gel buffer：,10% SDS：,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,五、第二向电泳SDS-PAGE电泳,3、灌胶： 灌胶时使胶液沿着灌胶口斜面的厚塑料垫板流下，动作均匀，灌至液面到灌胶口平为止。迅速在胶面上加入水饱和正丁醇压平液面，加入时使枪头贴着玻璃长板缓慢划动均匀加入，当所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌胶器的缝隙处也各加入2mL使内外液面相平，然后再加正丁醇至没过短板为止。蒙上保鲜膜过夜。,辉骏生物： 免费服务热线：400-

15、699-1663,4: 电泳 （1）用1x电泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS-PAGE整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。 （2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1 x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳。电泳条件为， 2W/gel 45min后改为17W/gel继续电泳，当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。 10 SDS 电泳缓冲液，1% SDS，250mM Tris-base，1.92M Glycine。