分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切

1、胶回收,-EZNAGel Extraction Kit,实验原理,回收柱（硅胶膜）在高盐、低PH值的情况下吸附DNA，在低盐、高PH值的情况下释放DNA。 我们知道原理，就知道了影响胶回收的几个影响因素，PH值、高盐试剂、低盐洗脱试剂。,实验步骤,1. RT-PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下观察。为防DNA损伤，避免长时间的紫外光照射。 2. 用刀片或凝胶尺切下含有所需DNA带的凝胶，置于1.5ml离心管中，称重。 3. 往离心管中加入胶重的等量体积的Binding Buffer（即每100mg胶加入100 ul Binding Buffer）. 4. 50水浴10分钟，使凝胶完全

2、熔解，在水浴过程中每23分钟漩涡震荡混匀一次。 5. 将离心柱放入2ml收集管中，将上一步熔解的凝胶导入离心柱中，10,000g离心1分钟。弃残液。 6. 将离心柱重新放回收集管；加入300ul Binding Buffer，10,000g离心1分钟。7. 弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管，再加入700 ul SPW Wash Buffer，静置2-3分钟，10,000g离心1分钟。 8. 重复步骤7一次。 9. 弃去收集管中的液体，空柱放回收集管，再10,000g离心1分钟。 10. 将离心柱放入一个干净的1.5ml离心管，加入2050ul去离子水到柱子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。

3、收集管中的溶液即为已纯化的GAPDH基因DNA片段。,连接,1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 l。 pMD18-T Vector*1 1 l DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 2）加入5 l（等量）的 Solution I。 3）16反应30分钟。,pMD18-T Vector图谱,转化,转化(Transformation)：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R

4、-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。,CaCl2转化原理,正在生长的大肠杆菌在0C下加入到低渗的冰冷的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。 感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的羟基钙磷酸复合物。 42C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。,转化步骤,1. 于超净台中取连接产物10l与100l大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。 2. 42热休克90秒，置冰

5、浴中3-5分钟。 3. 于超净台中加LB培养基900l，37水浴1小时。 4. 4000rpm离心3分钟，弃上清，取残余液体重悬细菌。 4. 取l上述混合物均匀涂布于含100g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。 5. 37孵箱培养1216小时，可见长出单菌落。 6. 挑选单菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，或提质粒酶切、测序鉴定。,质粒提取 -E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I 原理：,在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件

6、下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,步骤：,挑选一个单菌落,37过夜培养1416小时。 取1.55ml 菌液，10,000g 离心1分钟。 弃上清，加入250l 溶液I/RNase，漩涡震荡重悬细胞。 加入250l溶液，轻柔上下颠倒旋转混匀46次，室温放置2分钟。 加入350l溶液，轻柔上下颠倒混匀得到白色沉淀。 10,000g 离心10分钟。 将上清转移到HiBindTM DNA柱上,置于2ml离

7、心管上。注意不要吸到沉淀。 10,000g 离心1分钟，弃残液。 用500l HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液。 用700l DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去残液。 用700l DNA wash buffer第二次洗柱10,000g离心1分钟，去残液。 空柱子10,000g离心1分钟。 将HiBindTM DNA转移至一干净的1.5ml离心管，于膜中央加入50l ddH2O或TE溶解质粒。10,000g 离心1分钟收集质粒。,核酸定量,核酸的定量的方法： （1）电泳比较法 。 （2）紫外分光光度法 紫外分光光度法比较常用

8、 核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为测定核酸溶液度提供了基础。 A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长,紫外分光光度法原理,测定核酸溶液在260 nm的光吸收，样品溶液吸收光的量(吸光度)正比于溶液中溶质的量。吸光度与溶液中核酸浓度间的转换关系依据Lambert-Beer 定律： A=260 C L 其中：A：吸光度(OD)260 ：溶液中核酸在260 nm的摩尔消光系数(单位，L/mol.cm)C：溶液浓度(单位，mol/L)L：光路长度(单位，cm),核酸纯度分析,A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长 A260/A280比值可进行核酸

9、样品纯度评估： 理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否纯化样品。,酶切限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶 . 在分子生物学与遗传工程领域作为工具酶有广泛的应用 . 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。,鉴定正反,TA克隆有两种插入方式，造成正反向 常规PCR使得3端多出一个A碱基 5 nnnnnnnnnnA 3 3 A