等电点电泳 原理 步骤 详细.ppt

1、,李莉,等电聚焦电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,一、IEFE 定义,IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质的电泳技术。 Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.,上海交通大学医学院,等电聚焦(Isoelectric focusing ,I

2、EF)就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,二、IEFE的特点,（一）优点 High Resolution High Sensitivity Good Reproduction,上海交通大学医学院,（二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI

3、不溶或发生变性的蛋白质。,上海交通大学医学院,分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不同的生物大分子。,Q M = 6r,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,三、IEFE的基本原理,上海交通大学医学院,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pHpI pHpI pH pI,上海交通大学医学院,在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形成一个由

4、正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。,上海交通大学医学院,蛋白质分子的电聚焦过程,+ pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带,+,上海交通大学医学院,在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 The proteins become focused into sharp stationa

5、ry bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,进行IEFE必须具备3个条件：,有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带,上海交通大学医学院,（一）pH梯度的建立,用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好的pH梯度,上海交通大学医学院,1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具

6、备的特征：,分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； 化学性质稳定； 各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； 在pI处具有足够的电导，导电性均匀； 两性电解质载体的数目要足够多； 可溶性好； 对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。,上海交通大学医学院,2.载体两性电解质的合成,本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH310,丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）,加成反应,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,3.pH梯度的形成,载

7、体两性电解质(Carrier ampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度(pH gradient)。,上海交通大学医学院,没通电时的变化 所有的载体两性电解质(Carrier ampholytes)分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷(net charge)为零。,上海交通大学医学院,引入电场时的变化 载体两性电解质(carrier ampholytes)分子将向阴极(cathode)或阳极(anode)迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。

8、其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。,上海交通大学医学院,电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质(carrier ampholytes)分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应： 正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e- 负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH- 在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化,上海交通大学

9、医学院,由于载体两性电解质(carrier ampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH，当环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正极移动。,上海交通大学医学院,当环境pHpH时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。,上海交通大学医学院,同样载体两性电解质(carrier ampholytes)中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点(isoelectric point,pI)处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一

10、个pH梯度。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,（二）支持介质(medium)的选择,作用：防止扩散 抗对流 liquid medium：蔗糖、Ficoll gel medium：agarose、sephadex、PAG,上海交通大学医学院,（三）聚焦后的检测方法,各种染色法 扫描与定量 其它检测方法,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,四、IEFE的应用Applications of IEF,1.分析分离制备蛋白质、多肽 区分人血清蛋白 测出异常免疫球蛋白 基因分型 csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第

11、一相,上海交通大学医学院,双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,上海交通大学医学院,考马斯亮蓝,银染,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,实验 血红蛋白的等电聚焦电泳,Hb具有四条多肽链（、）,上海交通大学医学院,HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。,上海交通大学医学院,HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成人的正常浓度，以后HbF一直存在。,上海交通大学医学院,器材,电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头,上海交通大学医学院,试剂,Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）,上海交通大学医学院,操作,1.凝胶的制备 2