影响生物修复的环境条件.ppt

1、环境条件与生物降解,一、 非生物因子对生物降解的影响 二、 生物因子对生物降解的影响,物理、化学和生物等环境条件都会影响微生物的生存和活动，即影响微生物的种类、生物化学转化速率和生物降解产物。 如不同地点取样的微生物对同一个污染物代谢情况有很大差异。,第一节、 非生物因子对生物降解的影响,物理化学因子 矿质元素供应 氧气 生长因子 多种基质作用,一、 非生物因子对生物降解的影响,1、 物理化学因子 包括： 温度，pH，土壤水分，盐分，水压（深海和深层土壤） 每种微生物对环境都有一个耐受范围。超过了范围，降解作用就不会发生。,（1） 温度 一般是随温度增加而增加 （2）pH 一般用石灰调节酸性土

2、壤 （3）水分 土壤水分是重要限制因子。最适宜的水分是田间持水量的30-90%。 最适水分取决于土壤特性，化合物种类已厌氧还是好氧转化。 含油污泥的生物降解的最适水分为田间持水量的30-90%。,(4) 盐分 设计渗透压 （5） 压力 海底高压力不适应微生物降解。 尽管调节上述因子有利于提高生物修复的效率，但是，在经济上是不可行的。 不过，在反应器中，或者在可控环境中调节温度、水分、pH值可以是生物降解反应达到最佳。,2、养分供应 （1）碳源 碳源对细菌和真菌的生长很重要。 有机物污染物在环境界面上的有机碳浓度很高，一般不会成为限制因子，但N、P含量很低，而K，S，Mg，Ca，Fe等通常不缺。

3、这是NP经常成为限制因子，需要添加的原因。 由于共代谢等多种原因，向环境基质中加入有机物或单一化合物往往会促进污染物的降解。 见表5-1,BHC： 六六六 MCPA： 2甲4氯,通常，在土壤中加入联苯可以加速PCBs 的矿化。,如何促进有机物降解，是研究的重要内容之一。,（2）氮和磷 一般，微生物要求C：N20：1；C：P50-100：1 无论是海水，还是土壤中，加入氮磷肥料是促进石油类污染物降解的有力措施。 肥料开发：亲油性肥料（oleophilic fertilizers） 辛基磷酸盐，癸基磷酸盐，石蜡化尿素，十二烷基尿素。,在DEHP存在条件下，无NP时，菲根本就不矿化分解,通常是同时加

4、入多种养分（NP）促进作用会更大些。,3 生长因子 营养缺陷型（auxotrophs）:指不能制造某种生长因子（氨基酸、维生素等） 海水中90%，沉积物中75-80%的微生物是营养缺乏型。,4 氧气供应 原油和烃类的降解需要充足的氧气。氧气是仅有的或优先电子供体。 在深水、土壤和地下水中由于氧气的限制，常常导致降解恨慢或不能进行。 典型的修复策略是增加供氧，如强制供气，添加过氧化氢等,5 多种基质作用 在自然条件或污染条件下，污染物通常是多基质的（multiple substrates）。微生物在多种基质存在下的降解行为是有很大差别的。 多种机制作用的现象 其一、多种有机质可以同时被利用 解释

5、：可能是微生物各自有不同的基质,其二、一种基质可以促进另一种基质的利用 解释： 添加一种基质促进了微生物的生长，从而导致对另一种基质的利用； 一种基质是共代谢物，因此，添加后，促进另一种降解； 添加某种化合物，诱导微生物产生分解酶； 两种化合物中有一种浓度很低，低于生长阈值，另一种化合物可以提供能源，从而促进衡量物质的降解。,其三、一种基质可以减缓另一种基质的利用 解释： 一种化合物毒性很高，抑制微生物生长而造成另一种化合物降解变缓 一种化合物的产物不利于第二种微生物群体的生长 由于某种降解微生物的增加，对营养竞争的结果导致另一微生物生长受到抑制 其四、基质可以被顺序利用,第二节、生物因子对生

6、物降解的影响,协同作用 捕食作用,生物因子对生物降解的影响,1 协同作用 例子： 许多生物降解需要多种微生物的合作。 单一菌株不能降解，而混合菌株能降解。 如节杆菌属(Arthrobacter)和琏霉菌属(Streptomyces)在一起时才能矿化二嗪磷。,协同作用的机制,（1）提供生长因子 （2）分解不完全降解物 （3）分解有毒物 （4）分解共代谢产物,2 捕食作用 环境中有大量的捕食、寄生微生物。主要有： 原生动物: 有抑制(捕食)和促进（分泌生长因子和提供养分）两种作用 噬菌体 真菌病毒 蛭狐菌属(Bdellovibrio) 分枝杆菌 集胞粘菌 能分泌分解细菌真菌细胞壁酶的微生物,第三节

7、 微生物系统的人工调控,一、 微生物的驯化 二、 菌株接种 三、 基因工程菌,一、 微生物的驯化,1 驯化期的概念,图7-1 2, 4, 5-T除草剂在不同土壤中的消失情况 2, 4, 5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-三氯苯氧乙酸,土壤和水体受到污染后，特别是受到不容易生物降解的有机物污染后，污染物开始不发生降解或降解很慢，但经过一定时间后污染物迅速降解。 从污染物进入环境到污染物开始迅速降解这段时间间隔称为驯化期（acclimation period）,或称适应期（adaptation period）、停滞期（lag period）。,

8、驯化期长短1小时到几个月不等。 表7-1,驯化及其在污染物处理中的应用,工业废水处理：活性污泥的驯化。开始时，用少量工业废水，一定时间后，增大工业废水比例。 菌种筛选上的应用：通过人工措施是微生物逐步适应某种特定环境，最后获得由较高耐受力的特定微生物。,2 驯化的后效应,驯化期的结束标志着降解期的开始。经过一段时间后，再加入相同的化学品，可能出现的现象包括： 立即降解，没有停滞期 停滞期很短 有的化合物没有驯化效应,3 农药加速降解现象,农药的加速降解（accelerated pesticide degradation）或促进生物降解(enhanced microbial degradatio

9、n). 具有此现象的农药：2，4-D；2甲4氯；灭草敌；丁草敌 无此现象的农药：莠去津（atrazine）；西马津；毒死稗等。 在生产上，为了延长农药的作用期，需要使用延缓剂，主要是抑制降解生物的活性。 丁草敌的延缓剂是地虫硫磷和二乙磷。,4 影响驯化的因素,1）环境因子： 温度，pH，通气性，NP浓度。 2) 地点: 有些微生物在一个地点可以被驯化，但在另一地点则不然。 3） 基质的降解性,5 产生驯化期的原因,1）初始群体太小 通常在土壤、天然水和污水、废水中能够利用合成有机化合物的微生物群体数量是很少的，有时只有几个。,2）毒物的存在。一是污染品浓度太高，有毒；二是污染品中含有高毒化合物

10、 作用方式： 单纯抑制：仅使降解菌生长受到抑制 抑制快生菌：这种快生菌可能就是优势菌 毒性产生：毒物并不存在，但在降解过程中产生 毒性消除：存在于污染物中的毒物逐渐挥发降解消失。,3）原生动物的捕食作用： 证明:在污泥降解中，加有原生动物抑制剂的驯化期明显缩短。 4）新基因型的出现 期间，发生高效降解基因的突变和转移，然后形成优势微生物。这个过程需要的时间就是驯化期 5）酶的诱导和停滞期,二、菌株接种,1 接种的目的：微生物无处不在，在环境中有各种各样具有降解能力的微生物群落，如果能充分发挥这种能力，有机物就会迅速降解。那么是否还有必要对污染地点进行接种？答案不能简单的肯定或否定，而要根据具体

11、情况通过实验来确定。 接种（inoculation）又叫生物强化（bioaugmentation）目的是： 1) 加速污染物的降解 2）克服微生物的不均匀性 3）缩短驯化期 4）恢复微生物区系,2 菌株的富集(enrichment)和分离(isolation) 1）一般降解菌的富集和分离 富集培养技术：这是一种常用的选择性培养技术。做法是： 选择某些因子（炭源、氮源、通气条件、受氢体，温度、pH，或光照）造成特殊的环境条件； 若要分离特定有机物的降解菌，富集时就要用该有机物作为唯一的碳源和能源。不添加其他有机物，但要添加无机盐。,采用含有各种微生物的样品（如土壤或污泥） 油田的污泥和沉积物含有

12、大量的石油降解菌，是很好的材料。因为这些材料是经过自然选择和富集的。 这些材料中 特种微生物的数量很高。,让最能适应该生长条件的微生物生长速率超过其他微生物并占优势。 自同样条件下反复培养， 最后在含有同样成份的固体平板上进行培养，就很容易地将富集到的株系分离出来。,2）异生素降解菌富集和分离技术 异生素往往具有高毒性，非水溶性，高挥发性和不稳定性。 A 困难与解决办法 毒性：一些异生素，如低分子溶剂，本身对微生物具有较高的毒性。一般1%就可以杀灭微生物。 办法： =加入土壤，通过吸附降低毒性。 微生物的可耐受浓度通常是50-100 g/g =不断向基质加入低浓度的异生素, 憎水性 解决办法是

13、通过分散作用或使用惰性亲水载体增加界面。 使用两相（水-有机溶剂）系统对难降解有机物降解菌的富集、筛选十分有效。 水相为无机盐溶液，有机相为惰性溶剂如正十六烷、环庚烷和硅油。难降解的污染物溶解在有机相中。微生物在两相界面或水相中利用污染物。, 挥发性 办法：不断添加或在密闭系统中进行 热稳定性 有的异生素热稳定性差，造成消毒困难。 采用过滤法消毒。,B 常用分离技术 分离注意： 异生素分解菌生长很慢，不容易将它们和噬寡碳营养菌区分开； 异生素不能做唯一碳源时，必须补充加入少量复杂有机物如酵母膏或土壤浸液，增加了复杂性 异生素的不溶性使培养液混浊，增加了判断的复杂性, 残留分析和生长情况的判断

14、将异生素分离提取后，用GC，HPLC，和化学方法测定，如生物呼吸仪 也可用同位素14C标记技术测定, 降解菌落的选择 从固体培养基上挑选所需菌落，一般需要利用菌落的生理特征区别菌落。例如，降解菌菌落会溶解培养基周围的不溶物而在菌落边缘形成透明带。 双层琼脂技术 显色技术,3）共代谢基质降解菌的富集与分离 由于共代谢是不与微生物生长相联系的基质降解过程，使用降解基质作为唯一碳源行不通。 通常采用的办法有： 类似物富集技术 选择与基质类似的物质加入到体系中，获得的纯培养物能共代谢该化合物。 类似物与共代谢物具有相同的碳骨架，但不会阻断生物降解和基质利用 相关酶的测定,4）同生菌的富集和分离,具有协

15、同共栖关系的两个或多个微生物种群叫同生菌。 两种微生物只能协同降解同一种污染物。即使加入生长因子或满足其他条件也不能使同生菌中的每个菌团独立存在。,systems are widely used in wastewater treatment and have been used in the large scale continuous culture of bacteria.,恒化器是研究微生物生长动力学的有力工具。同时，也是微生物种群分离的有效手段。向恒化器中接种土壤或其他环境样品，并不断地提供试验有机物溶液作为唯一碳源和能源，在这种条件下生长快的微生物就保留下来，其他微生物被逐渐淘汰出

16、恒化器系统。,恒化器,是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的，因而可称为外控制式的连续培养装置。可以设想，在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。 恒化器主要用于实验室科学研究中，尤其用于与生长速率相关的各种理论研究中。,6）“

17、加速进化”与富集分离,活体的遗传工程（in vivo genetic engineering） 又称“质粒协助分子育种(plasmid-assisted molecular breeding)” 它利用环境中存在的微生物在选择性压力下于恒化器中长期培养，通过各种微生物间质粒的自然传递和相互作用来完成构建新菌株的目的，加速了新的异生素降解菌自然进化的过程。,3 接种成功的案例,在反应器中、固体床反应器中、砂滤池处理的地下水中，接种微生物一般会取得成功。 但在自然土壤、含水层及地表水中接种不易成功。 土壤：加入假单胞菌菌株和联苯可以使土壤中的PCBs消失。,4 接种失败的原因,在实验室培养得到的微

18、生物，接种到环境中后并不具有优势，导致接种失败。 营养限制 捕食者和寄生物的限制 移动能力 其他（基质浓度太低，pH，毒物等）,三、基因工程菌,利用遗传工程技术可以构建新的微生物。这些新的微生物具有现有微生物不具备的分解代谢能力，或者能在现有微生物不适合的条件下进行分解活动。 应用： 构建新的微生物 创造新的代谢途径 增加微生物某个代谢酶的数量和活性 创造能降解多种污染物的超细菌 创造某种特定性质的细菌,基本概念,染色体（chromosome） 质粒（plasmid） 质粒的特点： 1）自我复制（self-replication） 2) 共价闭合环状结构(covalent closed cir

19、cular DNA) 3) 质粒的相容性(compatibility)与不相容性(incompatibility),4)质粒的消除（curing）、整合(integration)和重组(recombination) 5) 质粒的转移性 转化(transformation)：在细胞之间不接触或没有载体介入的情况下的基因转移。受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，受体菌获得部分新的遗传性状。 转导(transduction)：有噬菌体为媒介，把供体细胞的一小段DNA片段携带给受体细胞。 接合(conjugation）：供体菌(F因子菌株，F+)通过性纤毛与受体

20、菌（不含F因子，F-）相接触，F+传递不同长度的单链DNA给F-。 接合和转导可以在自然环境中发生，转化这一般需要在人工条件下进行。,1 多质粒菌株的构建 美国构建“ 多质粒超级菌” (multplasmid super bug)消除海上石油污染。 将不同假单胞菌的不同菌株的四种降解性质粒接合转移到一个菌株中，构建成一株能同时降解芳香烃、多环芳烃、萜烃、和脂肪烃的超级细菌。,基因重组,2 基因工程菌的构建,The structure of nucleotides. The sugar in this case is ribonucleic acid,A schematic of the bon

21、ding of one DNA strand to another,胞嘧啶,尿嘧啶,Structure of ATP and Conversion of ATP to ADP,+ 7.3 kcal per mole,3 原生质体融合技术,应用实例,1 扬子石化与南京大学、香港大学、国家环保总局南京环境科学研究所联合承担的国家863计划项目“跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的研究”。 运用了基因工程，融合了3个跨界亲株微生物，构建出特效菌株。该菌株兼具了各种传统菌株的高降解性、高适应性和高絮凝性等特点。经过合作各方4年的努力，逐步建立起基因表达、营养条件、工艺操作3项优化调控技术，对二甲苯、苯

22、甲酸、邻苯二甲酸、4羧基苯甲醛和对苯二甲酸5种有机污染物的降解率分别高达86、94、99、97和94，总有机碳去除率达到94；,2 南京农业大学李顺鹏组用原生质体融合法构建了能将就甲胺磷、敌敌畏、和对硫磷的降解菌。,应用实例,第四节 影响植物修复的环境因子,与微生物一样，影响植物修复的因子包括pH，Eh, 共存物质，污染物交互作用，生物因子等。 以重金属植物修复为例。,一、pH,1 改变重金属的生物有效性。 （1）降低pH, 重金属溶解度增加，反之，亦然。 （2）土壤pH影响离子活度。 （3）土壤溶液pH降低，大多数重金属元素在土壤固相的吸附能力和吸附量下降。 如，酸性沙土中，pH每降低0.5

23、, Cd的吸附降低1倍，植物的吸收量增加。 有些元素相反，如As以阴离子存在，提高pH反而降低其吸附。,二、Eh,S的氧化还原电位： Eh=-0.139+0.07 x lg(SO42-/ H2S) 随着Eh降低，硫化物大量形成，土壤中的重金属离子就减少。 如Eh为416mV时，糙米含Cd是Eh165mV时的2.5倍。,Eh对Cd结合形态转化的影响,1）在还原条件下，有机结合态镉最稳定； 2）在氧化条件下，有机结合态的镉则被转化为生物可利用的水溶态、可交换态或溶解络合态而释放到水体中，并随Eh增大，释放量增加。,Eh/mV,Cd释放,可交换态,不溶性有机结合态,50,350,三、共存物质,1 络合-螯合剂：主要代表是EDTA、DTPA 作用机理：与溶液中可溶性离子结合，防止被土壤吸附或沉淀。 应用例子： 加入EDTA后，玉米、豌豆对Pb的吸收增加20倍。同时，增加Pb向地上部运转120倍。 因此，使用螯合剂使普通植物变