分子生物学课件：2016基因治疗

1、吉林大学基础医学院 College of Basic Medical Sciences, Jilin University,基因治疗,Gene Therapy,第一节：基因治疗的概念,基因治疗是指将人有功能的正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞内（与宿主细胞染色体发生或不发生整合），并表达其蛋白质产物，以达到纠正或补偿缺陷基因的功能的效果。,Gene Therapy refers to transfer genetic materials into a patient for a therapeutic goal.,Use of nucleic acids to repair mal

2、functioning DNA sequence or induce a compensatory change as to restore the normal physiological functions of the cell,（重点）,患者是一位患有严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）的四岁小姑娘艾姗蒂 她从父母处各继承了一个有缺陷的腺苷酸氨酸酶基因（ada），造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶，而腺苷酸脱氨酶是免疫系统完成正常功能说必需的。,理想：,实际：,即：基因修饰的细胞。,定义：将患者的每一个细胞的缺陷基因,都用正常基因通过同源重组的原理进行替换校正。,目前，我们只能将向受缺陷基因影响的

3、关键细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的原有缺陷基因并未去除。通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。,基因置换（gene replacement ),基因添加（gene augmentation）,我们能为她做什么？,第二节、基因治疗的基本策略,gene therapy strategies,（一）缺陷基因精确的原位修复,基因矫正 gene correction,基因置换 gene replacement,致病基因的突变碱基进行纠正,用正常基因通过重组原位替换致病基因,（二）基因增补,不删除突变的致病基因，通过导入正常基因，使体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。 这种方法

4、称为基因添加（gene augmentation）或称基因增补（Gene Supplementation） 。 是目前临床上使用的主要基因治疗策略。,（三）基因沉默或失活,有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。 这一策略称为基因失活（gene inactivation）或基因沉默（gene silencing）。,Supplementation,replacement,inactivation,Kill specific cells,o

5、r,or,or,Gene therapy strategies,Effect,ways,To cure,Add a functioning copy of the gene into the genome,Disorders by loss of function of a gene,Exogenous gene inhibits the expression (or activity) of pathogenic or malfunctioning gene (or gene product),Disorders by gain of function of a gene,Disorders

6、 with a defective gene,Exogenous copy replaces nonfunctional target gene through homologous recombination,Transfer suicide gene into cells,Disorder cells such as cancer cells,summary,第三节、基因治疗的基本程序与技术,3.治疗基因的表达,1.选择治疗基因,2.选择运输治疗基因的载体，将治疗基因转入患者体内,通常采用“缺什么补什么”的原则。,采用的载体？,进入细胞的外源基因必须完整无损。,*,载体,目的基因,靶细胞,

7、（一）基因治疗的2 种方式,Ex vivo,In vivo,治疗基因导入到病人体内的2 种方式,Patients with relapsed and/or refractory B-cell malignancies expressing the cell-surface protein CD19 can be treated successfully using adoptively transferred autologous T cells genetically engineered to express a CAR recognizing CD19.,Treatment of pat

8、ients with B-cell malignancies using anti-CD19 CAR T cells,Chimeric antigen receptors,Klebanoff, C,A. et al. 2014,治疗基因导入到病人体内的2 种方式,1. 选择治疗基因,（三）基因治疗的5个基本步骤：,2. 选择靶细胞,3. 选择携带治疗基因的载体,4. 将治疗基因导入人体（细胞）,5. 检测治疗基因表达,细胞内的基因在理论上均可用于基因治疗。可有针对性地进行选择。 只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因做基因治疗。 发现切实有效的治疗基因是成功的关键！,1.

9、 选择治疗基因,（三）基因治疗的5个基本步骤：,2. 选择基因治疗的靶细胞,造血干细胞,肌细胞,体细胞,3. 选择携带治疗基因的载体,基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类，多选用病毒载体。,用于基因治疗的野生型病毒的改造原则,保留感染性、去除致病性,逆转录病毒载体,基因治疗常用病毒载体,腺病毒,A. 逆转录病毒载体（retrovirus ）,5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）,LTR: 在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。,两端各有一LTR ( long terminal repeat, 含promoter

10、 Si RNA.,Transfected DCs,2. 恶性肿瘤的基因治疗策略,（1）针对癌基因的治疗,（2）针对抑癌基因的治疗,（3）增强机体免疫功能的基因治疗,世界首个抗肿瘤 基因治疗: 重组人p53 腺病毒注射液。,基因添加 是 目前 主要使用的 基因治疗 策略！,（4）自杀基因治疗（suicide gene therapy）,定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为有毒性的产物，达到消灭肿瘤的目的。,2. 恶性肿瘤的基因治疗策略,phosphorylated,HSV-TK,4. Treated with ganciclovir,suicide ge

11、ne therapy : introduce toxic gene,1. Inject brain tumor with engineered retrovirus carrying HSV-TK gene,Toxic,GCV,Gene therapy for brain cancer,TK gene: suicide gene,As to cancer in central nervous system , dividing cell in the midst nondividing cells.,2. Retrovirus particles infect dividing tumor c

12、ells and express HSV-TK,丙氧鸟苷 (无毒的核苷类似物),3. Tumor cells are modified,Example,TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。,自杀基因系统,第五节 基因治疗的概念及策略,一、基因治疗的策略,（四）自杀基因治疗（suicide gene therapy）,The field is t

13、heoretically good. A. Eliminate the need for repeated administration of drugs； B. As a new approach, GT has been proved to be successful in treating some diseases that is difficult to be cured with the present methods.,Prospects,At present ,we can only conduct somatic cell gene therapy(体细胞基因治疗). It

14、only involves the treatment of an individual and perhaps only a single organ or tissue in that person., 基因疫苗，利用完整的基因或基因片段在体内表达出抗原分子，通过调节免疫系统功能达到预防和治疗疾病的目的； 反义RNA/RNAi，作为基因药物可以通过其余细胞内特异性mRNA互补而封闭特定表达的方式达到治疗疾病的目的； CpG ODN，是通过细胞表面的TLRs结合，激活机体免疫细胞而调节免疫系统功能达到治疗疾病的目的。,展望,Gene therapy is in its infancy, bu

15、t promising,展望,In this century, GT will become common practice. Tomorrows physicians will be molecular surgeons.,基因治疗尚有重要问题待解决,第三节 基因治疗的应用,Single gene defects,二、 Cancer gene therapy,三、 AIDS gene therapy,第一节,基因治疗的策略、程序和基因转移的载体,第二节 基因治疗的临床应用现状,一、基因治疗可修复错误基因、或补偿基因的功能、或干扰基因的表达,二、利用载体把目的基因导入到受体细胞表达是基因治疗的

16、 基本程序,三、病毒载体和质粒载体均可用于导入目的基因,一、用正常基因替代错误基因治疗 单基因遗传病,二、肿瘤的基因治疗可在多个环节进行,三、HIV感染的基因治疗 的主要 策略是干扰 病毒复制, 缺乏高效、靶向性的基因转移系统 缺乏切实有效的治疗靶基因 对治疗基因的表达还无法做到精确调控，也无法保证其安全性,插入染色体,重点： 基因治疗的定义、策略、 Ex vivo gene therapy；In vivo gene therapy； 基因治疗中常用的病毒载体及其优缺点。 难点： 肿瘤的基因治疗可以采用哪些策略 基因治疗的应用现状、问题、前景,基因治疗 总结,基因治疗是通过改变人体细胞内遗传物质