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1、微生物的基本知识回顾,1.什么是微生物： 微生物（microorganism, microbe）是一类个体微小、结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称。 2. 微生物的特点： 个体微小，结构简单:细胞大小以微米和纳米计量。 种类繁多、分布广泛：一克沃土中含菌量高达几亿甚至几十亿 生长繁殖快，代谢能力强：大肠杆菌（Escherichia coli）在适宜的条件下，每20分钟即繁殖一代，24小时即可繁殖72代。 遗传稳定性差，容易发生变异：自发突变频率为10-6左右,细菌的性质,1 菌体形态:球，杆，螺旋,革兰氏染色1884年丹麦医师Gram所发明,真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌、革

2、兰氏阴性菌,约40层网状肽聚糖覆盖在细胞表面，磷壁酸贯穿于肽聚糖层，形成厚约2080nm的细胞壁； 磷壁酸贯穿其中；,革兰氏阳性菌（G+）细胞壁结构,内壁层：靠近细胞膜，为12层网状肽聚糖； 外壁层： 脂多糖（LPS）、磷脂层和脂蛋白层；,革兰氏阴性菌（G-）细胞壁结构,脂多糖的结构模型,O-特异侧链 核心多糖 类脂A,内毒素,热源质,细菌的特出结构,芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆形或椭圆形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。 功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力 ，有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维持生命的所有功能。 特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物和酸

3、类；对溶菌酶有抗性 。,细菌的特出物质,热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶性） 内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质A）一般与细胞结合在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释放出来，故称内毒素。少量内毒素0.001g入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑， 体温调节中枢引起发热。 作用特点：没有组织器官的选择性 肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤 不能经甲醛脱毒,2、菌落（colony）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长

4、、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌落单位为CFU ( Colony-Forming Units )。,众多菌落连成一片,菌苔（lawn）,通常情况下，纯培养能较好地被研究、利用和重复结果， 因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、 纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础。,3 细菌纯培养的群体生长规律,把一定微生物接种到一定量的液体培养基中，在一定条件下进行一次性培养，定时取样测定活菌数，以活菌数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线（繁殖曲线）. 一般把典型生长曲线划分为适应期、对数增长

5、期（指数期）、稳定期和衰亡期等四个时期。,球菌（直径）： 0.5 1 mm 杆菌（直径长度）： 0.2 1 mm 1 5 mm,青霉的分生孢子头,根霉的孢子囊和孢囊孢子,酵母菌是对一类单细胞真菌的通称； 有球形、卵形、椭圆形、圆柱形等； 大小在5-20 m,霉菌的细胞呈分枝或不分枝的丝状，直径约210 m,细菌菌落 放线菌菌落 霉菌菌落,酵母菌,2010年版中国药典微生物检验主要增修订内容,1.培养基的质量控制 2.菌种的质量控制,1.微生物检验培养基质量控制技术,培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。,1.1培养

6、基制备过程中的注意事项,1.1.1培养基的水化 培养基水化时不得用铜锅或铁锅,以防有离 子混入培养基中,影响微生物的生长； 配制培养基最常用的溶剂是纯化水 ,不能含 有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；,培养基制备过程中的注意事项,1.1.2 培养基的溶解 在培养基分装灭菌前,各成分应溶解均匀, 使用电炉等设备煮沸培养基时,应用小火加热,并边加热边搅拌,避免培养基焦化或爆沸溢出。,培养基制备过程中的注意事项,1.1.3 培养基的灭菌 已配制好的培养基必须立即灭菌 湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间,培养基制备过程中的注意事项,1.1.4 培养基的pH 微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长

7、繁殖 或体现其生物特性。 调整培养基的pH,应用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调整pH，一般灭菌前比最终pH高0.20.3。,培养基制备过程中的注意事项,1.1.5 培养基的保温 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。,1.2 培养基质量控制（2010版药典）,培养基适用性检查,计数培养基,控制菌检查用 培养基,1.2.1培养基适用性检查的基础,一、对照培养基 系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。,1.2.2 计数培养基适用性检查,大肠埃希

8、菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 白色念珠菌,营养琼脂培养基 Nutrient Agar (NA),玫瑰红钠琼脂培养基,酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基 （YPD） Yeast Peptone Dextrose Agar,50-100CFU,1.2.2 计数培养基适用性检查,结果判定 被检培养基上的菌落平均数 对照培养基上的菌落平均数 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致, 70%,菌落计数法证明培养基生长能力USP,USP要求每批配制培养基作促生长能力测试 菌种选择（变化大）：每个微生物单独测试 大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草 沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲 方法：

9、在培养中加入少量中（不超过100cfu）的微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。标准： 计数结果与标准接种物的计算量差别小于系数2（即 计数结果在标准接种物数量的50%-200%）。,1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查,促生长能力 抑制能力 指示能力,检查项目,1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查,增菌培养基促生长能力检查： 分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。,培养基基本要求,1.2.3

10、控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查,固体培养基促生长能力检查： 取试验菌各0.1ml（含菌数50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。,培养基基本要求,USP控制菌检查用固体培养基能力检查：,使用表面涂布法，在培养中加入少量中（不超过100cfu）的微生物，在规定温度下培养不超过规定的最短时间。清楚的观察到与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。 注：有生长就行，无数字上要求。,1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 抑制能力检查,培养基抑制能力检查： 接种不

11、少于100cfu 的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。,针对选择性培养基：胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、四硫磺酸亮绿培养基；（金黄色葡萄球菌） 溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基，亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，念珠菌显色培养基。（大肠埃希菌）,1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查,固体培养基指示能力检查： 取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情

12、况等应与对照培养基一致。,针对鉴别培养基,1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查,液体培养基指示能力检查： 分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。,针对鉴别培养基,典型特征,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB，曙红亚甲蓝) 上典型特征,典型特征,黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂Rose Bengal Agar 上典型特征,典型特征,金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠Mannitol Salt Agar 琼脂上典型特征,典型特征,沙门

13、氏菌在SS琼脂上,沙门氏菌在BS琼脂（亚硫酸铋琼脂）上,培养基质量控制（2010版药典）,实验室配制的培养基的常规监控项目 pH 适用性检查试验 定期的稳定性 检查以确定有效期,2.菌种的质量控制2.1 概念,标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。,中国医学菌种保藏中心提供的

14、标准菌株,美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株,法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball),低温冷冻保藏的标准储备菌株,低温蜡封保藏的标准储备菌株,我所制备的工作菌株,中国药典2010年版 在方法的附录中对菌种的规定同2005年版 在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定 允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商

15、业派生菌株仅可用作工作菌株,菌种鉴定 简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如API鉴定条 基本程序为： 对疑似菌种进行纯培养 进行染色镜检 根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信息，选择合适的鉴定条 根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果 也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统,菌种的管理,菌种的采购 菌种的复苏 菌种的传代 菌种的保藏 菌种的使用和销毁,菌种的采购 每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。 所购菌种均

16、为冷冻干燥菌种。 采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置46暂存。,浙江省食品药品检验所菌种管理程序：,菌种的复苏 菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。 菌种复苏应在生物安全柜内操作。 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。 取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。,浙江省食品药品检验所菌种管理程序：,菌种的传代

17、应在生物安全柜中进行菌种的传代 。 取经过纯度鉴定的第1代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。 接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养56天，黑曲霉宜培养57天，其他菌种一般培养1824小时。,浙江省食品药品检验所菌种管理程序：,菌种的保藏 保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70。 在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。 所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。 该方法保藏菌种的有效期规定为6个月 。,浙江省食品药品检验所菌种管理程序：,菌种的使用和销毁 本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外

18、提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。 本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在菌种领用记录上记录菌名、数量、领用人等信息。 外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购买。 本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一套冷冻干燥菌种传代制备第1代原种保存）。 过期菌种应及时销毁，销毁时应经121 20分钟的生物灭活处理。,浙江省食品药品检验所菌种管理程序：,通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 优点 操作简便 成本低 比较容易掌握 缺点 保存期比较短 反复传代有引起变异的可能,通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法 优点 保存期

19、较长 反复传代导致菌种变异的风险较小 缺点 操作相对复杂 成本较高 操作流程相对较长，受到污染的风险较高,菌种保藏方法举例,申请号/专利号： 200810124325 本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养天，确定无菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于点。倒入高的无菌液体石蜡，用封口膜密封，竖直存放入的电冰箱中保存。采

20、用本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。,斜面保藏法:,一般使用营养琼脂培养基,生孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基,在3035培养1824小时.存活时间13个月. 斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度,一般不宜低于4,也可以放置在室温中,但应控制温度不超过25 .,有关菌种的常见问题,阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定加入的菌液中的菌落数。是否可行？ 对照用菌液的制

21、备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进行稀释和确定菌浓度,菌种传代至第5代时，还能不能用该斜面菌种接种制备工作用菌液 严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典所指的传代次数不超过5代，应该是指用于实验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备成的斜面保藏菌种只能到第4代。,阳性对照是否必须购买菌种？有效期一般为多长时间？ 对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购 有效期根据不同菌种，不同的保藏方法而异，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌有效期一般为1个月，能形成芽孢的细菌有效期一般为3个月，真菌的有效期为3个月。,如何对菌种进行复壮，传代之前是否一定要做微生物学鉴定

22、，确认是否有变异。 复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐 微生物传代中的菌种确认是必须的。,以短小芽孢杆菌为例说说细菌鉴定 通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。 营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。 生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原 ，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐还原阴性。 采用API鉴定条，结合染色镜检和接触酶实验等结果,微生物基本操作,1、纯培养技术 2、微生物的计数 3、微生物形态的观察 4、微生物生理生化特性测定,干热灭菌：160-180 2h,高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)： 121

23、15-30min,试管、瓶子、培养皿等,常用的灭菌方法：,常用的器具：,一、纯培养技术 1、微生物培养的常用器具及其灭菌,无菌环境的保证： 无菌室：万及洁净区 净化工作台：万及洁净区下的局部百级 酒精灯：外焰温度最高，r=5cm的球形区为无菌区,1）无菌环境,微生物的环境器皿及培养基的无菌,操作者的外界环境及操作过程的无菌（环境及操作的无菌）,2） 无菌操作,火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行,2、接种,3 分离纯培养 平板划线法（streak plate method）,2.划线接种，分离纯化,Inoculating an agar plate to obtain single colonies

24、,二、细菌、霉菌、酵母菌的计数：,菌落总数的测定方法（活菌计数法），主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法使用郝氏计测玻片 。 酵母菌的总数测定，可采用血球计数板进行显微镜直接镜检计数。 酵母菌的死活鉴定可以通过0.1%的美兰染液染色2-3min完成，活菌不着色。,USP对菌落计数方法分析,菌落数的回收率可变范围大：可能在+/-0.5log10单位左右，即真实值为A时，结果在100.5AA/100.5。（100.53.16） 菌落计数结果一般不均匀，其对数值（log10）

25、近似正态分布。 平皿技术的相对标准偏差（RSD）一般在15-35%（与平皿上CFU的数量有关）可以用于评价实验结果是否有效，或是药典替代方法精密度判定标准之一。 应用过程中的相关规定比较：,与CP一致,固体培养基可计数范围（通过牛奶中大肠埃希菌的计数“验证”）：,CP规定细菌、酵母菌：30-300CFU USP推荐：25-250CFU 不包括膜法 对于黑曲霉建议：8-80CFU 当加菌量过大时，加菌量越大回收率越低 当加菌量极少时，加菌量越少误差越大,CP2005菌数报告原则,1 要求每片滤膜上的菌落数 应不超过100个。 2 平皿法菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间、霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 3 仅有1个稀释级