地中海贫血的诊断方法

1、地中海贫血的诊断方法B- 地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有：1 血常规检测地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如MCV80 fl，MCH250 Pg，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者，可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。2 红细胞渗透脆性试验 ( 一管法 )其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在032( 或036)NaC1中溶解度降低 ( 脆性降低 ) 。一管法可用于地中海贫血群体筛查。3 血红蛋白 (Hb) 电泳 Hb电泳是检测地中海贫血、 异常血红蛋白最常用的方法， 可观察到 HbE、H

2、bH等异常血红蛋白区带， 同时可定量检测 HbF、HbA2的含量并区分常见类型的地中海贫血。有研究显示MCV、Hb电泳和红细胞脆性实验三者联合检测的灵敏度可达100 ，阴性预告值达 100 ，联合特异度可达 100 ，阳性预告值达 100DS。4 高效液相色谱技术 (HPLC)原理：采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现重型和轻型B地中海贫血。在操作上， HPLC采用的是全血标本，不需要制备Hb液，只要将全血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。优点：所需样本量少，自动化程度高，操作简单，快速，能消除人为误

3、差，结果准确。 HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断，可诊断出重型 B地中海贫血， 但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿 。近年来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测。5 基因诊断近年来，随着分子生物学研究领域的不断发展， 从最初的 B珠蛋白基因簇限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应 (PCR)技术结合其他分子生物学方法， B地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。基因诊断方法有下列几种：51 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析 )原理：DNA限制性内切酶可识别并切割 DNA上特定的核苷酸序列， 得到一定长度的 DNA片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，从而改变酶切片段的

4、大小。 突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变， 根据这些改变可判断出突变是否存在。缺点：由于单独使用该方法，不能直接测出受试者突变基因的类型， 必须结合寡核苷酸探针等技术， 故其应用范围有一定限制，且操作繁琐。 如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子，无法用此方法进行产前诊断， 或者患儿和父母所有位点上都是杂合状态，只能进行 50 的排除性诊断。52 探针斑点杂交技术 ( allelespecific oligonucleotideASO) 应用引物扩增珠蛋白基因， 同时合成与正常序列和突变序列完全互补的寡核苷酸探针。将 PCR扩增产物点在尼龙膜上，

5、分别与标记的正常和突变的 ASO探针杂交，不完全互补的探针，在一定条件下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位B珠蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅与突变探针杂交。这种检测方法快速、灵敏。缺点：对DNA的纯度和数量要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异质性的B地中海贫血往往需要多次更换探针杂交，才能确定诊断， 如使用同位素标记探针，还存在放射性污染等问题。53 反向点杂交方法 (Reverse dot blothybridization，RDB)与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本原理相同，所不同的是：将膜上固定探针取代固定靶DNA，经一

6、次杂交就可对未知样品中多个突变进行检测， 改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。优点：较快速、敏感，操作简单。缺点：只能检测已知位点突变的B地中海贫血，不能检出未知突变。54 缺口 PCR(gap PCR)原理：设计三个或两对引物，即在缺失区域外侧， 靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一对引物在缺失区域内。 在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。在缺失区域外侧的一对引物，因为缺失使相距甚远的两端DNA拉进，从而可扩增出特定的DNA片断。从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。Wang等 报道用此方法对 89个B珠蛋白基因突变的检测。55 扩增不应

7、突变系统 (amplification refractorymutationsys tems，ARMS)或称等位基因特异性 PCR原理：在PCR中，针对某个点突变设计出 3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物，PCR反应中，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则不能扩增 。从而将正常与突变的 DNA区别开来。优点：仅需微量的DNA样品 (100 400 ng) ，通过简单的设计，仅需同一种 PCR循环体系便可同时探测常见 B珠蛋白基因突变， 无需 PCR之后的分子杂交等过程， 不需限制性内切酶及放射性核素。缺点：特异性较低，易出现假阳性或假阴性。有报道应用该方法进行 B地中海贫血的检

8、测 。56 实时荧光定量 PCR(real time PCR)在实验过程的 PCR体系中加入荧光集团， 由于被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，具体可以通过特定的定量PCR仪监测每次循环产生的荧光信号强度，并参照对照基因的标准曲线来定量，荧光染料能与所有的DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制。缺点：由于选取的相对定量和标准曲线本身存在局限性，所得结果存在误差。国内外有报道采用该方法进行 B地中海贫血的检测?。57 单链构向多态性 PCR(PCRSSCP) 与PCR联合应用，即PCRSSCP是一种基于单链 DNA构象差别来检测未知点突变的常用方法。原理： PCR产物在加热或变性剂下生成单

9、链，单个核苷酸的改变即可造成 DNA片断单链的改变。根据构象不同的单链 DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)条件下电泳表现不同的迁移率， 电泳带用银染法显示，无放射性核素污染。可用于检测B地中海贫血基因缺失的病人及携带者，是一种筛查未知点突变的有效方法。缺点：当 PCR产物小于200 bp 可检出 70 90的突变率，敏感度随PCR的长度58 等位基因特异性扩增技术(AlleleSpecificPCR，ASPCR)原理：针对 B地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物，根据扩增得到的电泳带判断是否存在对应的点突变，结果清晰、准确可靠，尤适用于小片段 DNA分析，可作为快速检测携带者的筛查手段

10、。59 DNA芯片技术 (DNA chip)以反向斑点杂交为基本原理。将预先设计好的大量核酸探针有序、 高密度地显微打印在玻璃片、 硅片等固体支持物上，制成 DNA微阵列。用荧光标记的待测样品 DNA、eDNA或 RNA与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度， 用特制的软件对荧光信号进行分析处理， 便可得到待测样品的遗传信息或表达信息。优点：高通量，基因诊断可在一张芯片上完成， 适用于大面积的筛查。 缺点：设备要求及费用较高，目前难以推广。510 DNA序列测定法 (DNA sequencing)常用于分析基因的未知或已知突变。 应用 PCR扩增产物在 DNA自动测序仪上进行序列分析。该法快速、简便、灵敏，重复性好，是基因突变检测的最直接、最准确的方法。511 荧光聚合酶链反应 (Fluorescent PCR) 荧光 PCR是近年发展起来的新兴技术， 它比普通的 PCR敏感性高出一千倍以上 。用不同