免疫原和抗血清制备技术.PPT

1、免疫原和抗血清制备技术,第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 抗体的纯化和鉴定,第一节 免疫原的制备,一、细胞性抗原的制备 二、可溶性抗原制备及鉴定 三、半抗原免疫原的制备 四、佐剂,绵羊红细胞的制备流程图,摇动 15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次 2000r/min 10min,NS稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,来源: 组织和细胞，其成分比较复杂。 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多

2、糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定,二、可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制备及鉴定,返回,组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液 澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹 及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10min,取上清液,去除细胞碎片 及微小组织,离心,细胞破碎技术及评价,1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理,细胞破碎技术及评价,常用酶类：溶菌酶、纤维

3、素酶、蜗牛酶等,1.酶处理法,1.酶处理法,方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。,特点：此法适用多种微生物； 具有作用条件温和； 内含物成分不易受到破坏； 细胞壁损坏的程度可以控制。,2.冻融法,原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。,2.冻融法,完,方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。,特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。,3.超声破碎法,原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生空化作用（cavitation）使得 液体形成局部减压引起液体内部发生流

4、动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。,3.超声破碎法,特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。,4.表面活性剂处理,原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。,4.表面活性剂处理,常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。,应用：破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。,蛋白质抗原制备,蛋白质是良好的抗原，要制备特

5、异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法,蛋白质抗原制备,1超速离心法,原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。,1超速离心法,特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。,应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等。,2、选择性沉淀法,原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。

6、,2、选择性沉淀法,常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用3350饱和度的硫酸胺。,特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。,应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,4离子交换层析法,原理：利用带离子基团的纤

7、维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,4离子交换层析法,5亲和层析法（亲和色谱）,原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的

8、。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。,5亲和层析法（亲和色谱）,正常细胞 ,标记细胞 洗滴,标记细胞 被酶裂解,加入特异 性抗体,其它蛋白 洗涤流失,SDS-PAGE 分离蛋白,亲和层析法示意图,核酸抗原制备,大分子的核酸具有免疫原性。 提取核酸的主要步骤：,核酸抗原制备,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,类脂多糖抗原制备,苯酚法提取LPS：,干燥菌体或湿菌体,水中 混匀,激烈搅匀 加热5min,冰水 急冷,降至10以下,离心,上层的水层(含LPS) 下层的酚层 菌体残渣于底部,吸取 水层,透析 除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS 在上层沉淀的透明胶状部

9、内,绞出,悬于水中,离心,得纯化LPS,类脂多糖抗原制备,同温的苯酚,免疫球蛋白片段制备,1酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。,免疫球蛋白片段制备,2氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。,3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc段，用以制备抗重链血清,F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶 （papain),胰蛋白酶 (pepsin),胃蛋白酶 (pepsin),1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破

10、坏。,氧化法和还原法评价,返回,2. 还原法：将二硫键还原成琉基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。,纯化抗原的鉴定,1.含量鉴定 2.理化性质鉴定 凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验,纯化抗原的鉴定,蓝色,1含量鉴定,在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。,方法：酚试剂法鉴定 主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸 原理：,蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能,钨酸、钼酸,还原,3H2OP20513WO35MoO310H20 和3H2P20514WO3

11、4MoO310H20,络合物的双缩脲法,蛋白质Ca2+,碱性,加深,含量鉴定,蓝色,理化性质鉴定,已知分子量的标准品,测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。,凝胶柱,保留体积,分子量的对数,2.理化性质鉴定,绘制标准曲线,凝胶层析技术进行测定,垂直电泳,聚合成大分子凝胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。,PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理：,双丙烯酰胺 N,N-methylene bisacrylamide,Bis,丙烯酰胺

12、(acrylamide,Acr),催化剂,3. 纯度鉴定,方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。,返回,纯度鉴定,原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。,特点：快速简便。,三、半抗原免疫原的制备,1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。,三、半抗原免疫原制备,2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-载体连接方法:,载体类型,1

13、.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,载体类型,2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。,半抗原-载体连接方法1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透吸除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,混合,半抗原-载体连接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,载体蛋白-NH2,半抗原-N

14、=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂,半抗原载体连接方法2,半抗原-载体连接方法3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原-COOH,载体蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-载体蛋白,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-载体连接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-

15、COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,四、佐剂,* 概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增 加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。,四、佐剂,条件：增加抗原的表面积； 改变抗原的活性基团构型； 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部 组织的存留时间； 可直接或间接激活免疫活性细胞； 无毒性或无副作用。,（二）常用佐剂的种类和制备,1.氢氧化铝佐剂：,5%硫酸铝,5%氢氧化钠,氢氧化铝沉淀,制成悬液 即为佐剂,强烈搅拌,NS洗 二次,NS,等体积抗原,免疫接种,（二）常用佐剂的种类和制备,2.明矾佐剂,10%硫酸钾铝,氢氧化钠校正pH值至6.5,

16、沉淀,乳状悬液,* 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。,NS搅拌,NS洗 二次,离心,抗原,备用,防腐剂,作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽种和溃疡 不能用于人体,弗氏完全佐剂,3.弗氏佐剂(Freund adjuvant),液体石蜡,完全乳化,备用,高压 灭菌,加热,抗原,弗氏不完全佐剂,卡介苗,羊毛脂,鉴定,一滴 乳剂,乳剂不散浮于液面,水中,混合,4.佐剂应用原则和评价,目的:增强抗原对机体的免疫原性； 增强抗体的产生能力； 为制备出高效价的免疫血清； 增强可溶性抗原的免疫原性； 在某种情况下，改变Ag免疫应答类型； 延长抗原在免疫动物的时间； 改变抗原的分布；

17、增强局部对变应原的超敏反情况；,4.佐剂应用原则和评价,应用佐剂的缺点, 佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性；,应用佐剂的缺点, 注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿；, 反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。,第二节 免疫血清的制备,1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离及保存,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,一、免疫动物选择,1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；,2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；,3

18、.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；,4.按需要量选择大小不同的动物。,二、免疫方法,3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.免疫原的注射剂量,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,三、动物采血法,1.颈动脉放血法：最常用的方法 2.心脏采血法：要求操作熟练 3.静脉采血法：,1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40，可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,三、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,第三节 抗体的纯化和鉴定,1.抗体特异性的纯化 2.特异性IgG类抗体的纯化 3.特异性抗体的鉴定,一、抗体特异性的纯化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液