戚豫-1--遗传病的实验室检查手段-超级简化版.ppt

1、遗传病的实验室检查手段进展,北大医院实验中心 戚豫 研究员,2020/9/29,1,2007,Illumina推出Solexa; ABI推出SOLid 均能在3天内完成1人的全基因组测序,2020/9/29,2,2020/9/29,遗传病和基因的数量？,遗传病总数：14,861种(Online- Mendelian Inheritance in Man, OMIM, by 2015-3-21) 人类基因总数：24,000个 人类各种结构和功能蛋白：100,000种 89种表型和基因全清楚；4,381种表现找到致病突变意味着可做直接的基因诊断的病种很少！ 已知序列：10,391个基因可做间接诊断

2、的很多！,3,“遗传病” 概念,广义：所有疾病。因为一切人体正常生理功能和病理状态都是由基因决定的 狭义：因基因突变而引发的疾病 如何区分三个概念： 遗传性疾病：与环境因素引起的疾病对立 先天性疾病：可以是围产期感染/药物所致 家族性疾病：可能随着成员的迁出而终止,2020/9/29,4,发病频率总计占我国出生人口5.6%；为全球平均57倍,每一项只占万分之几到千分之几 按系统分类排名前5位： 神经系统：智力低下、代谢障碍、癫痫 心血管系统：先心病 内分泌系统：糖尿病、肾上腺皮质增生 生殖系统：不孕不育 骨骼系统：多指/趾-并指/趾、软骨发育不良,2020/9/29,5,2020/9/29,先

3、天性疾病的诱发因素,遗传原因 后天环境所致，因素： 物理：X-ray、微波、超声波、热 化学：砷、铅、汞（水俣病）等无机物； 橙剂、EB（溴乙啶）等有机物 生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等 围产期因素诱变，但不肯定致病 围产期因素只侵犯到个别器官，但注意与嵌合遗传（mosaic）区分,6,2020/9/29,如何检出？,高危人群 环境暴露 既往病史 家族史 感染史 迁居情况 ,遗传 DNA/RNA,环境,无论外来病原体还是本身异常， 遗传物质的检测都是有效手段,7,2020/9/29,实验室检测手段, 分辨率, 和范围,染色体核型Karyotyping:109bp, 2800

4、倍镜下可见 荧光原位杂交FISH: 107bp, 一个基因的一部分 多重探针连接扩增MLPA:105bp,几十个基因 比较基因组杂交CGH Array:105bp,几个基因 间接基因诊断: 103105bp,一个或数个基因 直接基因诊断PCR-Sequencing: 1bp, 一个基因 Affymatric chip: 1bp, 数千个基因, 半个基因组 Genome-Wide-Sequencing: 1bp, 全部2.4万个基因,注：bp, base pair, 碱基对,8,2020/9/29,从核型; FISH; array CGH; MLPA; 到CMA(chromosomal micr

5、oarray analysis, 染色体微阵列,分子核型)细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法,临床细胞遗传学的历史是伴随着一系列识别染色体方法的技术进步发展 临床细胞遗传学基本工作：核型分析 国内主要中期染色体核型，G显带在400条 国外高分辨染色体核型， G显带在1500条 条件 ：细胞培养，光镜，核型分析系统软件,9,2020/9/29,1、染色体核型 Karyotyping基于显微镜下浓聚的染色体形态,检查方法： G带、R带、Q带（550条，7组） 高分辨染色体分带（1500条） FISH（荧光原位杂交）：分裂间期 染色体畸变种类： 数目异常（整倍和非整倍） 结构异常:-;+;t; de

6、l; ins; inv; dup; inv dup; fra(X)(q27.3):脆性X; der:衍生染色体; r(13):13号染色体呈环状（暗示有缺失）; i(Xq):等臂Xq,10,2020/9/29,2、荧光原位杂交技术FISH (fluorescence in situ hybridization,),可以结合，但不依赖于核型分析 单色与多色FISH，如SKY-FISH(光谱式多色染色体) 是鉴别基因组发生较大缺失或重复金标准 不足：一次杂交识别的范围有限需要很好的临床诊断或其他提示，花费大人力多，设备高级 方法：探针标记，细胞或染色体的原位杂交 条件：探针(cosmid)、 DN

7、A 提取、PCR、真空干燥、图像采集与分析,11,2020/9/29,FISH需要条件荧光显微镜+图像分析系统,12,2020/9/29,3、多重探针连接扩增 MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification ) Schouten JP第一次描述一种基于PCR反应，通过毛细管电泳鉴定扩增产物是一种高分辨的，用于检测基因组序列拷贝数变异的方法 ( Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30(12): e57),13,2020/9/29,同时检测40个基因组序列异常，几乎每个染色体2个 近端粒常有微缺失涉及不育、

8、发育、智力，可一次查全 仅需要20ng的DNA 能检测单个外显子exon的拷贝数, 探针辨认短的基因组序列,部分变性的DNA,如石蜡包埋,甲醛固定的样本均可使用 相对定量40个mRNA,鉴定启动子的甲基化状态,检测已知的突变和SNPS,MLPA方法功能、特点,14,2020/9/29,M L P A 反应过程,15,2020/9/29,MLPA结果判定,相对峰域与对照相比减少35-50%判定缺失 相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复 突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少 单一的外显子缺失需要其他方法证实 结果分析2例,16,2020/9/29,17,20

9、20/9/29,18,2020/9/29,MLPA需要条件,PCR仪 测序仪,19,2020/9/29,4、比较基因组杂交 (Comparative genomic hybridization, CGH),什么是CGH: 1992年Kallioniemi创立的基于荧光标记和分子、细胞遗传学技术鉴定基因组DNA的获得、丢失和扩增，并且可以把这些遗传变异定位在正常的中期染色体上的一种技术 特点: 在一个实验中，用一张中期染色体涂片分析全基因组的大的DNA序列拷贝数的不平衡改变(获得和丢失)，即因剂量的变化而不需要分裂的细胞 缺点: 与测序相比分辨率不高，扩增子约2Mb，检出的缺失大小510Mb但也

10、是个优点：容易辨识和解释 1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH 目前最通用的是美国安捷伦公司(Agilent)的平台，已成为国际上遗传病诊断、流产组织分析和种植前诊断PGD的第一线手段(first-line),20,2020/9/29,Microarray BACs/PACs DNA探针固定在玻璃片上 Arrayed by robotically printing DNA onto slides Agilent scanner,Old array-CGH,21,2020/9/29,Patient 2 This patient presented t

11、o the Laboratory at 12 months of age with infantile spasms and developmental delay. His head circumference was below the 2nd centile and weight was between the 10 to 25th centile. Seizures continued daily. At a review at 32 months brachycephaly, low anterior hairline, hypertelorism, and a large prot

12、ruding tongue were some of the additional features observed. Subtelomeric FISH revealed a deletion of the distal 9q probe PAC112N13. Array-CGH showed the patient has a 1.5-1.8 Mb deletion of distal 9q. Further FISH evaluation established the deletion as 1.7Mb with breakpoints between the BAC clones

13、RP11- 83N9 and RP11-695L17.,22,2020/9/29,11q duplication,10q deletion,Patient 5 Male patient who presented at 18 years of age with intellectual disability, autism and dysmorphic features. Subtelomere FISH showed a unbalanced translocation, with an additional copy of the 11q probe PAC770G7 present on

14、 distal 10q. The distal 10q probe PAC137E24Gwas not present.,23,2020/9/29,New array-CGH?,用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参照 DNA 加入 Human Cot1DNA 在Microarray上进行杂交 杂交后洗去未结合的和错配的靶 DNA 高分辨扫描仪芯片,24,2020/9/29,双色激光扫描 红色 CY5 绿色 CY3 F 值产生,reference DNA,patient,=,25,真实扫描芯片图(8X60K 芯片),分析软件界面,2020/9/29,26,Cyto report: 给出23条染

15、色体图和分析表格（列出部分）,2020/9/29,27,2020/9/29,什么是基因诊断？,狭义：针对致病基因的突变分析是一种直接的诊断 扩展：利用致病基因的多态性(polymorphism) ；或利用相邻的多态性标记(polymorphic markers)进行连锁分析是一种间接的诊断 广义：通过对疾病发生的基础，包括复制(DNA)、表达(RNA)和翻译(蛋白质)加以全过程分析所做出的诊断,28,2020/9/29,基因诊断技术基础:PCR,聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) :1985年发明,1992诺贝尔奖 试管在热循环仪(PCR仪)中反应几

16、小时，待测基因片段，专一地扩增上百万倍,PCR过程： 加热变性：分开模DNA双链 冷却复性：使引物与目标序列特异结合 保温延长：使引物按模板序列延长,29,2020/9/29,PCR产物检测,PCR反应场所 以及,30,2020/9/29,不适合做PCR诊断的病种,染色体病 大片段基因缺失和重排所致的遗传病： 解决办法：细胞遗传学，荧光原位杂交FISH、多重探针连接扩增MLPA、比较基因组杂交CGH、基因芯片Affymatric array和大规模全基因组测序 基因巨大(Megabases)且无热点突变的遗传病：NF1、DMD、BMD、ADPKD etc. 解决办法：杂交、酶学、代谢产物、功能

17、分析，截短蛋白分析法(Protein Truncation Test, PTT)、色谱、串联质谱,31,2020/9/29,哪些遗传病可以做基因诊断? 需要查阅OMIM遗传病数据库(),32,2020/9/29,哪些遗传病可以做基因诊断? 基因诊断适用范围和必要性,有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗传病：long QT等心脏病、糖原累积症I型(von Gierke型)、癫痫等脑病 诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病：如PKU、肝豆状核变性和G6PD缺乏症 可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病，严重的精神疾患或恶性早期致死性疾病：如性别畸形和性发育异常而找不到

18、染色体异常。可通过选择性流产加以预防 传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病：多以常显、X连锁和母系方式遗传。可做连锁分析,33,2020/9/29,例如:家族性氨基甙类药物耳聋,对氨基甙类如卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉素、新霉素以及链霉素等超级敏感 条件致病使用氨基甙类药物 母系遗传线粒体DNA上编码12S rRNA的基因存在致病突变A1555G 一旦发现，可对全家进行该突变的筛查 发布用药禁忌,34,2020/9/29,-1(先证者) -2 -3 -4 AG: 线粒体mtDNA1555AG基因诊断( ：有突变),II-1 -2 -3 -4,氨基甙类耳毒家系的基因诊断示意图,I-1 I-2,

19、35,2020/9/29,例2 线粒体病的基因诊断,mitochondrion线粒体是细胞的能量工厂,36,2020/9/29,Leigh病- 亚急性坏死性脑脊髓病,严重性：在我院儿科临床诊断的35例中，死亡29例（83%）。目前生存仅仅6例。 Leigh病是一种线粒体病，但仅仅有20%由mtDNA突变突变所致，80%由核基因突变所导致。 基因检查：mtDNA突变检出率极低229临床诊断病例中仅仅检出3例：T8993C 2例和T8993G1例（死后尸解结果mtDNA Mut%：血=85%;肌肉=94%;脑=98%；其母外周血=10%）,37,2020/9/29,病例1、临床表现,男，4月，主因

20、精神发育倒退、惊厥入院 第一胎，孕9月疑潜在性缺氧行剖宫产，生后无窒息；2月内发育如常，后出现倒退，表现为颈部发软、四肢活动差、吸吮能力减弱、低热、阵发性呼吸暂停（28次/日） 检查：间断抽搐，四肢肌力、肌张力低下，病理征(-)。血乳酸高、代谢性酸中毒。EEG示左侧为主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI 示缺血改变：双侧壳核、丘脑区异常信号；脑白质发育落后。两次眼底检查未见异常呼吸节律不整，死前突然出现叹气样呼吸 父31岁、母30岁，均无遗传病家族史,38,2020/9/29,39,2020/9/29,40,2020/9/29,方法 PCR扩增mtDNA8791-9413片段(622bp

21、) 分别用限制性内切酶MspI和SmaI酶解PCR产物 2.5%琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段 对EB染色的片段进行密度扫描，突变比例（Mut%）=突变新增片段密度/原有片段残留密度+突变新增片段密度,结果 患儿体内存在高比例的8993TG突变 患儿1亲属中母亲含较低比例的同样突变 患儿1肌和脑组织病理检查符合婴儿型Leigh综合征诊断 患儿1 MRI示脑缺氧性改变,M 患儿肌肉 患儿血 母亲 阴性对,41,2020/9/29,患者L1以第1对引物扩增后PCR产物直接测序结果,T8993G,T8993C,患者L2以第1对引物扩增后PCR产物直接测序结果,42,2020/9/29,患者CT和 死后尸

22、解,43,2020/9/29,病理改变：灰质为主的海绵样改变，神经细胞坏死和毛细血管增生。陈旧病变出现胶质细胞增生，新鲜病变存在格子细胞。脑干黑质、舌下神经核、面神经核和前庭神经核在不同病人均受累。其他部位病变可以仅限于脑干，也可以同时累及脊髓灰质、基底节、大脑和小脑皮层以及白质。,44,2020/9/29,“间接法”基因诊断连锁分析 例：苯酮尿症(PKU)的诊断,致病基因：苯丙氨酸羟化酶PAH 方法：细菌抑制实验(筛查) 苯丙酮酸和PAH定量 基因诊断困难 70多种突变 基因大，突变很分散 检测突变成本高，周期长 直接检测突变或连锁分析?,45,2020/9/29,连锁分析方法产前诊断PKU

23、选择几对染色体标记(marker),A,B,连锁分析示意图,需要多态性标记（与PAH基因在染色体上的距离越近越好） 对先证者(BB)及家系成员(父-AB;母-BC;胎儿-AC)的标记进行分型(genotyping) 胎儿-AC：不受累！ 连锁诊断准确度：marker与致病基因的连锁程度有1%的交换率，理论可信度为99%,C,46,2020/9/29,产前基因诊断,对象：胎儿的DNA、代谢产物或酶蛋白 取材：绒毛(8周)、羊水(16周)、胎儿静脉血 手段： 针对代谢产物：HPLC、GC-MS(有组织特异性) 酶活性：特异性人工底物显色(有组织特异性) 针对基因：RFLP、PCR等 (无组织特异性

24、) 要求：双取样、双方法、有资质、有质控 准入：目前北京7家，专家委员会审核和年审 管理:北京市产前诊断与产前筛查工作规范 产前诊断技术管理办法,47,体细胞嵌合的遗传病（生殖细胞嵌合异常比例过低也不行） 组织器官异质性过大（线粒体病） 国家法律和行业规定不允许的范围，如“天才基因”儿的选择（遗传不平衡） 性别鉴定（除非性连锁疾病） 呈数量遗传的多基因病或遗传相关的复杂遗传病 以及 没有做好准备的家庭,2020/9/29,哪些病不适合产前基因诊断,48,非侵入性产前检查NIPT 血浆游离DNA突变检测技术,2020/9/29,49,母体血浆中的胚胎DNA,Lo YM et al. Fetal

25、cf-DNA detected via Y chromosome, Lancet 1997,胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA(cff DNA),母体外周血含有cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养细胞。 怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。（7周建立胎儿胎盘循环）。 cffDNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间。 母体外周血中的cffDNA含量在5%到30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。与母亲体重有关。 产后2hr之内消失。,2020/9/29,50,22条常染色体,23条常染色体,20% 胚胎 DNA,80%,染色体非整倍体导致剂量变化,20

26、20/9/29,51,技术和科学的目标,that government of the people, by the people, for the people, shall not perish from the earth. by Abraham Lincoln,2020/9/29,52,基因诊断的制高点多基因病： 能否靠基因芯片或微阵列解决？,2020/9/29,53,2020/9/29,划时代的新技术大规模二代测序NGS(Next Generation Sequencing) 人类基因组计划长达10年、耗资千亿、6国数万科学家投入，仅完成4个人的基因2007年：1人，3天内，3000美

27、元，费用和时间在以每年递减一半的速度下降取代所有一切，40种常见病发表。多基因病时代来了？,SOLEXA_illumina 1G Genome Analyzer,54,2020/9/29,Instrument without Covers,Fluidics 20个蜡纸or塑料盒/架;99冻存管/盒=2592032400管标本(3.5ml),条形码打印机,耐低温标签,扫码枪,2020/9/29,60,大型标本库的构成与核心,区域规划： 缓冲区 核心：库区 监控室 样本接收区 样本处理区 辅助功能区：用品库、办公室、更衣室,2020/9/29,61,62,是多功能的大型实验室： 研究 教学 临床基

28、因诊断 标本库 实验中心大楼位于北大医院门诊南侧,7 层, 面积7000m2 Central laboratory Research Teaching Clinical genetic diagnosis BioBank,简介：北京大学第一医院实验中心 （中心实验室）,2020/9/29,63,临床基因扩增诊断实验室Standard PCR Laboratory,300m2, strictly managed in CAP way Negativepressure double systems 100,000 level clean Lab Strictfunctionsandworkflow to avoid PCR contamination: Reagent Store