生化冬学期rna2013part2

1、第三节真核生物RNA的合成目 录基因转录调控与重大疾病的发生密切相关，是当今生命科学和医学研究的重点。真核生物细胞内贮存的遗传信息庞大，细胞结构复杂，因此转录过程也较原核生物更精细。和原核生物相比，转录起始过程也有较大差别，终止也不同。目 录原核与真核生物转录比较:enhancerpromoterstartpointAterminatortemplateTranscription Unitupstreamdownstream典型的真核基因示意图目 录1. Composition of the regulatory region: enhancer2. Accessory proteins (t

2、ranscription factors)3. Termination:更复杂目 录目 录一、真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶目 录RNA polymerase poison Amanita phalloides, a poisonous mushroom that produces a-amanitin每年世界上有数以百计的人因吃 “Amanitaphalloides”毒磨菇死亡。后来研究发现此磨菇含素，进一步发现这种毒素实际上是一种环八肽，能与pol II结合，抑制转录。这种磨菇因为非常的艳丽，故也叫“death angel”或“death cup”。目 录真核生物的RNA聚合酶有三

3、类，它们催化合成不同的RNARNA polymerase I: 18S, 5.8S和28S rRNA; resides in the nucleolus （核仁）；对a-amanitin不敏感RNA polymerase II: mRNA前体, hnRNA; locates in the nucleoplasm；对a-amanitin非常敏感RNA polymerase III: tRNA and 5S rRNAs; nucleoplasm（核质）；被高浓度的a-amanitin抑制目 录RNA in Eukaryotic Cells is synthesized by three types

4、 of RNA polymeraseEukaryotic RNA polymerases目 录目 录CTD: C-末端结构域, 由多个七个氨基酸组成的重复序列组 成，丝氨酸和苏氨酸被高度磷酸化, 对转录起始起重要作用。Eukaryotic RNA polymerase II二、转录需要有启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与原核生物和真核生物转录的重要区别在于：RNA pol与DNA 结合（原核）RNA pol与蛋白质 结合（真核）目 录1、转录起始点及起始真核生物转录起始也需要RNA-pol对起始区上游DNA序列辨认和结合，生成起始复合物。起始点上游有不同的DNA序列，对转录起很重要的作用，

5、统称为顺式作用元件。顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列。多数含共同序列TATA盒，这也是大部分启动子的核心序列。但一些管家基因可以没有TATA盒。目 录RNA聚合酶II许多RNA 聚合酶II识别的启动子具有保守的共有序列：位于转录起始点附近的起始子（initiator, Inr）启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列， 在起始点上游约-100至-40nt的位置，常见的是GC和CAAT盒增强子与特异基因调节蛋白结合，无固定位点， 距起始点的位置约100nt至50000nt，既可调节上游基因，也可调节下游基因目 录顺式作用元件 结构基因-GCGC-CAA

6、T-TATA转录起始增强子TATA盒CAAT盒GC盒 真核生物启动子保守序列 目 录2.转录因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)， 有时称为通用转录因子。对应于RNA-pol I、II、III的TF, 分别称为TF I、TF II、TF III。 TF II又分为TF II A 、 TF II B、 TF II D、 TF II E、 TF II F、 TF II H，在真核生物进

7、化中高度保守。目 录TBPTBP: TATA binding protein（结合蛋白），支持基础转录但不支持诱导等所致的增强转录。TAF： TBP associated factors, TBP辅因子，有多种， 在不同的基因转录中由不同的TAF辅助TF IID：由TBP和8-10个TAF组成，覆盖一个35bp或者更长的区域。 TF IID复合物中不同TAFs与TBP的结合可能结合不同的启动子。中介子（mediator）是在反式作用因子和RNA聚合酶之 间的蛋白质复合体，它主要促进TF II H对RNA聚合酶羧基端结构域的磷酸化。它又叫辅激活因子。目 录TBP上游因子: 与启动子上游元件如GC

8、盒、CAAT盒等顺式作用元件（cis-acting element）结合的蛋白质，比如SP1 结合到GC盒上，C/EBP结合到CAAT盒上。反式作用因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及起始复合物的形成，从而协调调节基因的转 录效率。可诱导因子（inducible factors）： 是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。它们能结合应答元件，只在某 些特殊生理成病理条件下诱导产生，如MyoD在肌肉细胞中高表达，HIF-1在缺氧时高表达。目 录参与RNA-pol转录的TF目 录转录因子亚基组成，分子量(kD)功能TFDTBP*38结合TATA盒TAF*辅助TBP-

9、DNA结合TFA12，19，35稳定TFD-DNA复合物TFB33促进RNA-pol结合及作为其他因子结合的桥梁TFF30，74解螺旋酶TFE57（a）34（b）ATPaseTFH蛋白激酶活性，使CTD磷酸化Binding of TBP with DNATBP不仅定位于小沟, 而且能使DNA 弯曲约 80oC.可能的功能: 使 DNA TATA 盒两边的空间结构发生变化, 使得转录因子和聚合酶更靠近.TBP :唯一的转录因子与 DNA的特异序列相互作用.目 录TBP is a universal factor for positioning目 录RNA polymerase III启动子位点,

10、 TFIIIB 与TFIIIC结合. 在RNA polymerase I启动子, SL1 与UBF1结合.TFIID 则仅与 RNApolymerase II结合.The ternary complex of TFIIb-TBP-DNA目 录Two views of the ternary complex of TFIIB-TBP-DNA show that TFIIB binds along the bent face of DNA. The two strands of DNA are green and yellow, TBP is blue, and TFIIB is red and

11、purple.RNA聚合酶催化基因转录的过程可分为4 个期：装配期起始期延长期终止期22目 录装配期RNA聚合酶II和通用转录因子形成闭合复合体u TATA-结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)结合启动子的TATA盒u TFIIB与TBP结合，TFIIB也能与DNA结合。TFIIA不是必 需的，它能稳定已与DNA结合的TFIIB-TBP复合体，并且在TBP与不具有特征序列的启动子结合时（这种结合比较弱）发挥重要作用u TFIIB-TBP复合体与由RNA聚合酶II和TFIIF组成的复合体结合u TFIIE和TFIIH加入，形成闭合复合体，装配完成23目 录起始期闭合复合体

12、成为可转录复合体u TFIIH具有解旋酶(helicase)活性，能使转录起始点附近的DNA双螺旋解开，使闭合复合体成为开放复合体，启动转录。u TFIIH还具有激酶活性，它的一个亚基能使RNA聚合酶II 的CTD磷酸化。还有一种使CTD磷酸化的蛋白质是周期蛋白依赖性激酶9 (cyclin-dependent kinase 9，CDK9)。CTD磷酸化能使开放复合体的构象发生改变，启动转录。u 当合成一段含有6070个核苷酸的RNA时，TFIIE和TFIIH释放，RNA聚合酶II进入转录延长期。24目 录 真核生物的闭合复合体的组装TPTAF BTATAATFD-A-B-DNA复合物POL-T

13、FFHEHETBPPOL-TAFCTD- P B TFFTATAA2闭合复合体组装完成，TFH使CTD磷酸5目 录化延长期 在整个延长期，TFIIF始终与RNA聚合酶II相连 延长因子(elongation factors)增强了RNA聚合酶II的活性 延长因子也能抑制转录中发生的转录暂停现象 延长因子协调参与mRNA转录后加工的蛋白复合体之间的相互作用26目 录真核RNA聚合酶与通用转录因子的作用过程27目 录核小体RNA-Pol转录方向RNA-PolRNA-Pol目 录转录延长中的核小体移位终止期一旦RNA合成结束，转录即终止。RNA聚合酶II去磷酸化，进入再循环，启动另一次转录。29目

14、录三、真核生物转录延长中没有转录与翻译同步的现象真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。目 录四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行 和转录后修饰密切相关。mRNAAAAAAAA 3 3加尾核酸酶5335RNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点目 录4. 模板理论(piecing theory)一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。目 录五 真

15、核RNA聚合酶和聚合酶启动转录与聚合酶基本相似RNA聚合酶和也有各自特异的通用转录因子，识别各自特异的DNA调控元件。聚合酶和聚合酶启动转录不需ATP，而聚合酶则需要水解ATP。目 录1. 真核生物RNA聚合酶启动的转录rRNARNA-pol 识别的转录控制区两个：rRNA前基因+1-100上游调控元件核心元件转录区人rRNA基因上游调控元件和核心元件34目 录有两种DNA结合蛋白能使聚合酶准确地启动rRNA前体分子基因的转录，一种叫上游结合因子(upstream binding factor,UBF), UBF先与DNA结合， 结合的部位是UCE和核心元件的上游部分，再由另一种叫选择性因子1

16、 (selectivity factor 1, SL1)结合，然后由聚合酶结合，并启动转录。SL1的一个亚基就是上面提到的TBP。35目 录36目 录.真核生物RNA聚合酶启动的转录tRNA, 5S-rRNARNA-pol 识别的启动子位于被转录的序列之中，称为内启动子 (internal promoter)。tRNA基因A boxB boxCbox37目 录5S-rRNA5S-rRNA基因的内部启动子tRNA基因的内部启动子起点AboxcB酿酒酵母(S.cerevisiae)的RNA聚合酶III启动的转录A TF FtRNA基因转录起始时，先由TFC 与A 盒和B 盒结合， 然后TFC和TF

17、B结合， 后者再结合到转录起始点上游约30bp处，RNA聚合酶启动转录。 TF 5SrRNA基因转录起始时，先由另一个被称为TFA的蛋白因子与C盒结合，然后TFC与TFA 结合， 再由TFB与TFC结合， RNA聚合酶启动转录 。38目 录A C boxAbox TF CT CtRNA基因转录 Pol TF B起点 box TF 5S-rRNA基因转录 Pol TFB第四节真核生物RNA的加工Post-transcriptional Modification目 录一、真核生物mRNA的转录后加工（一）首、尾的修饰 5端形成帽子结构(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A t

18、ail)目 录帽子结构目 录 帽 子 结 构 的 生 成 磷酸酶Pi5 pppGp5 ppGppppGppi5 GpppGpSAM 甲基转移酶5 m7GpppGp目 录鸟苷酸转移酶（二）mRNA的剪接1. hnRNA 和 snRNA核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclearRNA, hnRNA)snRNA (small nuclear RNA)snRNA核内的蛋白质小分子核糖核酸蛋白体（并接体, splicesome）目 录断裂基因(splite gene)真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组

19、成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。编码区A、B、C、D 非编码区目 录ABCD2. 外显子(exon)和内含子(intron) 外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。目 录目 录鸡卵清蛋白基因hnRNA首、尾修饰录、hnRNA剪接成熟的mRNA鸡卵清蛋白基因及其转转录后修饰目 录目 录mRNADNA鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图目 录3. 内含子的分类根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些核生物的rRNA基因；真II：也发现于线粒体、叶绿体，转录

20、产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。目 录目 录4. mRNA的剪接 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。 snRNP与hnRNA结合成为并接体目 录E1U6U4U5UGE2UACUACA - AGU1U2U1、U4、U5E1U6UGE2UACUACA - AG目 录 内含子外显子1外显子2UpAGpU 剪接过程的二次转酯反应pG-OH(twice transesterification)第一次转酯反应(ppG-OH,pppG-OH)U-OHpGpAGpU第二次转酯反应G-

21、OHpGpAUpU目 录5. mRNA的编辑(mRNA editing)mRNA（14500个核苷酸）mRNA编辑 RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。目 录肠道细胞apo B48（分子量为240 000）肝脏apo B100（分子量为500 000）二、真核前体rRNA的加工在 细 胞 中 每 个 基 因 的 拷 贝 数 是 不 一 样 的 ， 有些 基 因 在 染 色 体 上 串 联 重 复 ( t a n d a m这些基因属于丰富基因族（ r e d u n d a n tg

22、 e n e ) ，g e n e ） 。r D N A （ 编 码 r R N A ） ， 5 Sr R N A 、 组 蛋 白基因、 免疫球蛋白基因等等都属于丰富基因族。真核细胞内45S转录产物是18S,28S和5.8SrRNA的前体。目 录二、真核前体rRNA的加工rDNA转录45S - rRNA 剪十接18S - rRNA5.8S和28S-rRNA目 录18S内含子5.8S内含子28SrRNA成熟后，在核仁内与蛋白质一起形成核糖体，输出胞质。细胞生长时，rRNA较稳定，但当细胞增殖停止时，rRNA易降解，半衰期短。目 录三、tRNA的转录后加工tRNA在蛋白质合成中起重要作用。细胞内的tRNA有40-50种，编码它们的基因种类和拷贝数量都很多。以酵母tRNA-tyr为例，其加工分为以下4步：5端的16个核甘酸前导序列由RNase P切除；3端的两个核苷酸由RNase D切除，再由核苷酸转移酶加上CCA； 柄-环结构的一些核苷酸的碱基经化学修饰为稀有碱基，甲基嘌呤、假尿嘧啶核苷（ ）、某些腺苷酸脱氨成为次黄嘌呤核苷酸（I）；通过剪接切除中部为14个核苷酸的内含子。目 录目 录三、tRNA的转录后加工DNATGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCRNA pol tRNA前体目 录目 录RNAas