12.食品中维生素的测定.ppt

1、1,食品分析与检测,2,一、概述 二、脂溶性维生素的测定 三、水溶性维生素的测定,第十一章 食品中维生素的测定,3,一、概述,维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类微量有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物,4,1.维生素具有的共同特点 （1）这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在； （2）不能供给机体热能,也不是构成组织的基本原料； （3）主要作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量极小； （4）一般在体内不能合成，或

2、合成量不能满足需要，必须经常从食物中摄取； （5）缺乏会导致相应的疾病。,5,2.维生素的分类 脂溶性维生素 包括维生素A、D、E、K 水溶性维生素 包括B族维生素（维生素B1、B2、PP、B6、叶酸、B12、泛酸、生物素）和维生素C。,6,3.测定意义 （1）食品科学研究者需要准确的食品成分分析信息，计算营养素的膳食摄入，以改善人类的营养； （2）食品营养价值评价 （3）食品生产工艺设计及强化食品的评价 （4）食品资源开发 （5）食品标签的准确性,7,4.测定方法 （1）涉及人体和动物的生物分析方法； （2）利用原生生物、细菌和酵母等的微生物分析方法； （3）化学法、分光光度法、荧光法、色谱

3、、酶法、免疫和放射等物理化学分析方法。,8,化,9,脂溶性维生素的理化性质 溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。 耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定； VE对酸稳定，对碱不稳定。 耐热性：VA、VD、VE耐热性好，能经受煮沸 耐氧化性：VA易被氧化，光、热促进氧化 VE易被氧化，光、热、碱促进氧化 VD性质稳定，不易氧化,二、脂溶性维生素的测定,10,在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 对于A、D、E、K共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。,测定脂溶性维生素的流程,皂化样品,水

4、洗去除脂类物,有机溶剂提取,脂溶性维生素(不皂化物),浓缩,溶于适当的溶剂,测定,11,维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。,（一）维生素A的测定,12,13,（1）三氯化锑比色法 （2）紫外分光光度法 （3）荧光法 （4）气相色谱法 （5） 高效液相色谱法。,维生素A的测定方法,14,1.三氯化锑比色法,维生素A在氯仿溶液中与三氯化锑相互作用，生成蓝色可溶性物质，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其颜色深浅与维生素A的含量在一定的浓度范围内成正比，故可比色测定

5、。,原理,15,适用于维生素A含量较高的样品（高于 5-10g /g ），对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，不易比色测定 该法的主要缺点：是生成的蓝色物质的稳定性差。比色测定必须在6秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。,适用范围及特点,16,注意： （1）维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃仪器避光。 （2） 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。,17,仪器,回流冷凝装置 分光光度计,18,（1）无水硫酸钠,试剂,（2）乙酸酐,（3）乙醚：不含有过氧化物,（4）无水乙醇,（5）氯仿

6、(三氯甲烷）,19,（6）250g/L三氯化锑氯仿溶液,（7）50氢氧化钾溶液 （8）0.5mol/L氢氧化钾溶液,（9）1mg/mL维生素A或视黄醇乙酸酯标准溶液,（10）酚酞指示剂,20,准确吸取维生素A标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度。 分别吸取上述各标准系列溶液lmL于比色皿中，各加乙酸酐1滴，摇匀，于620nm处，以氯仿调节吸光度零点，将其标准比色液按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑氯仿溶液。于6s内测定吸光度，以维生素A含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。,操作步骤,（1）标准曲线的绘制,21,皂化,（2）样

7、品处理,根据样品性质，处理方法可采用皂化法或研磨法。 皂化法：适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A损失。,提取,洗涤,浓缩,22,水层,分液漏斗1号,提取,23,振摇，静置，分层,洗涤,24,水浴蒸馏,减压抽干,氯仿定容（25mL),无水硫酸钠,浓缩,25,（3）测定 取2支比色皿，分别加入1mL氯仿和lmL样品溶液，各加入1滴乙酸酐，于620nm波长处以氯仿调节吸光度零点，将其移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑氯仿溶液。于6s内测定吸光度。,26,结果计算,C -由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量（g） m-样品质量（g） V1-样

8、品提取液的总体积（mL） V2-测定用样品提取液的体积（mL）,X- VA含量（mg/100g),27,研磨,研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于510g样品的测定，如动物肝脏的检测。步骤简单，省时，结果准确。,提取,浓缩,（3）测定,同皂化法,28,结果计算,式中：C -由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量（g） m-样品质量（g） V1-样品提取液的总体积（mL） V2-测定用样品提取液的体积（mL）,29,（1）本法为国家标准方法，适用于食品中维生素A的测定。 （2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇。 （3）所用氯仿中不

9、应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每lmL氯仿中应加入乙酸酐l滴，以保证脱水。,说明与注意事项,30,（4）由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求反应在比色皿中进行，产生蓝色后应立即读取吸光值。,（5）如果样品中含有-胡萝卜素(如奶粉、禽蛋等食品)干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。 （6）三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。,31,（二）胡萝卜素的测定,胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种

10、异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有 -紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中以-胡萝卜素效价最高。,32,胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。可用有机溶剂提取, 在450 nm 波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。 但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取 -胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。,33,纸层析法,是以滤纸及其结合水形成的复合物作为固定相，将待分离的样品溶液点在滤

11、纸的一端，在密闭的容器中，用适宜的溶剂（展开剂）作为流动相，带动样品斑点，从滤纸的一端向另一端迁移，此称为展开。由于样品中各组分与滤纸亲和力的强弱差异，及在展开剂中溶解度的大小不同，在展开过程中，经过反复的吸附、解吸，经一定时间产生差速迁移，使样品中各组分得以分离。经显色剂显色，可在滤纸上看到分离的斑点，这些斑点就是通常所说的色谱。,34,在两相中，吸附力弱，溶解度大的组分，迁移速度快，斑点距原点的距离就大；反之则相反。 纸层析是一种简单、迅速、有效的分离、鉴定或定量有机物质的方法。在食品检验中，多用于糖类、氨基酸、维生素等成分的分析，以及食品中有害物质如黄曲霉毒素、有机氯农药和有机磷农药残留

12、量的分析。,35,原理,以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。,36,仪器,玻璃层析缸 皂化回流装置 分光光度计 旋转蒸发器 恒温水浴锅 点样器或微量注射器,37,试剂,（1）石油醚(沸程3060) （2）丙酮 （3）丙酮石油醚（3：7）混合液 （4）无水硫酸钠 （5）50g/L硫酸钠溶液 （6）50氢氧化钾溶液 （7）无水乙醇 （8）500g/mL-胡萝卜素标准溶液,38,标定：取标准溶液10l，加正己烷3.0mL，混匀，在波长450nm测定吸光

13、值，以正己烷为空白，平行测定三份，取平均值。,式中：A-标准溶液的吸光度 -胡萝卜素标准溶液浓度（mgmL） E-胡萝卜素在正己烷溶液中，波长450nm,比色皿厚度为lcm，溶液浓度为1mg/L的吸光系数，其值为0.2638 3.01/0.01-稀释倍数 1/1000-将mg/L换算成mg/mL,39,蔬菜与其他植物性食物：取可食部分用水洗净后，用纱布吸去水滴，切碎，用组织捣碎机制成匀浆，贮于塑料瓶内于冰箱中保存备用。,（1）样品的采集和制备,粮食：样品用水洗净，置60烘箱中烘干，磨碎，贮于塑料瓶内，盖紧瓶塞保存，备用。,测定步骤,40,以下步骤需在避光条件下进行。 （2）样品处理： 粮食、蔬

14、菜样品：取匀浆1.00005.0000g，粮食样品视含量而定，置100mL具塞三角瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇lmin，静置5min，将提取液转入盛有100mL 50g/L硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于三角瓶中加入10mL丙酮+石油醚混合液，振摇lmin，放置5min，将提取液并入分液漏斗中，如此提取23次，直至提取物呈无色为止。,41,植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(小于10g)，加入脱醛乙醇30mL， 1:1氢氧化钾溶液10mL，加热回流30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液呈无色为止。,（3）洗涤,（4）浓缩与定容,（5）纸层析,42

15、,点样：在1830cm滤纸下端距底边4cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D 4点，吸取0.10.4mL浓缩液在AB和CD间迅速点样。,43,展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，放于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行展开。,洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。,（6）比色测定 以石油醚调节零点，于450nm波长下比色，测吸光度，以其值从标准曲线上查出-胡萝卜素的含量。,44,（7）标准曲线绘制 取浓度为50g/mL -胡萝卜素标准液0、1、2

16、、3、4、6、8mL，分别置于100mL具塞三角瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.1mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0g。在测定低含量样品时，可在02.5g间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。,45,结果计算,式中：-胡萝卜素的含量（mg/100g） C-在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量（g） V1-点样体积（mL） V2-样品石油醚提取液浓缩后的定容体积（mL） m-样品质量（g）,46,1.本法为国家标准方法，适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出量为0.

17、11g。 2.浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。 3.定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。,说明与注意事项,47,（三）维生素D的测定,维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l 0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D3。其结构为环戊烷多氢菲的衍生物。,+,环戊烷多氢菲,菲,环戊烷,48,（1）三氯化锑比色法 （2）紫外分光光度法 （3）薄层层析法 （4）气相色谱法 （5）高效液相色谱法,维生素D的测定方法,液相色谱法的灵敏度高，操作简便，精密度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。,49,1.三氯

18、化锑比色法,在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，在500nm处有最大吸收，呈色强度与维生素D的含量成正比。,原理,50,（1）食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇等成分的含量往往都大大超过维生素D、严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。 （2）操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响。 （3）此法测定值是维生素D2和维生素D3的总量。,说明及注意事项,51,（四）维生素E的测定,维生素E又称生育酚，属于酚类化合物。目前发现有8种。,52,（1）比色法 （2）荧光法 （3）气相色谱法 （4）高效液相色谱法,维生素E的测定方法,比

19、色法：操作简单、灵敏度较高、特异性差 荧光法：特异性强、干扰少、灵敏、快速、简便 高效液相色谱法：灵敏度高、操作简便，精密度高，在短时间内可完成同系物的分离定量。,53,1.荧光法,样品经皂化、提取、浓缩蒸干后，用正己烷溶解不皂化物。在295nm激发波长，324nm发射波长下测定其荧光强度，并与标准-维生素E作比较，从而计算出样品中维生素E的含量。,原理,54,（1）样品处理,测定方法,乙醚层经无水硫酸钠过滤，氮气流真空蒸干，正已烷溶解，定容。,55,激发波长：295nm 发射波长：324nm 激发狭缝：3nm 发射狭缝：2nm 样品及标准溶液分别置于1cm比色杯，测定荧光激发光谱和发射光谱，

20、读取最大激发波长、最大发射波长下的荧光强度F。,（2）荧光测定,结果计算,X- VE含量（mg/100g),56,2.比色法,维生素E能将高铁离子还原为低铁离子，低铁离子与，-联氮苯发生颜色反应，在波长520nm处有最大吸收，可以进行比色测定,原理,57,（1）在皂化时，用氮气流保护，也可加入焦性没食子酸作为抗氧化剂，防止维生素E的氧化。 （2）此法反应没有特异性，故处理前应将其他还原性物质除去。 （3）也可采用4，7-二苯基-1，10-菲绕啉作为发色剂，其灵敏度比，-联吡啶高2.4倍。 （4）维生素E的各种异构体与试剂的反应速度、呈色强度各不相同。 （5）由于光能促进维生素E氧化，因此尽可能

21、避光操作。,说明及注意事项,58,三、水溶性维生素的测定,水溶性维生素B和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，多余的都会随尿液排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。,59,水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，持别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响； 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏； 维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。,60,（一）维生素Bl的测定,维生素Bl又名硫胺素，通

22、常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。 分析方法：GB/T 5009.842003中唯一的方法是硫色素荧光法。,61,（二）维生素B2的测定,维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。 分析方法：GB/T 5009.852003中第一法为荧光法。第二法为微生物法。,62,（三）维生素C的测定,维生素C是一种己糖醛基酸，又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、

23、苦瓜、猕猴桃、柑桔等食品中含量丰富。 维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3 -二酮古洛糖酸，失去生理作用。,63,测定维生素C的方法 2，6 - 二氯靛酚滴定法 2，4 - 二硝基苯肼法 荧光法 高效液相色谱法 磷钼蓝杂多酸比色法 碘量法,64,2，6 - 二氯靛酚滴定法、碘量法、磷钼蓝杂多酸比色法：测定的是还原型Vc含量，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质（如Fe、Sn、Cu等）会干扰测定，使结果偏高。对深色样液2，6二氯靛酚滴定法的滴定终点不易辨别。 2，4 - 二硝基苯肼比色法与荧光法：测定的是Vc

24、的总量。 高效液相色谱法：可以同时测定还原型Vc和脱氢型Vc含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点。,65,(一） 2，6 - 二氯靛酚滴定法,用2草酸提取植物组织中的Vc，而后用2，6 - 二氯靛酚标准溶液进行滴定，根据消耗的2，6 - 二氯靛酚标准溶液的体积，即可计算出样品中的Vc含量。,原理,66,2，6 - 二氯靛酚具有酸碱指示剂和氧化还原指示剂的作用 氧化型的2，6 - 二氯靛酚在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈浅红色， 还原型的2，6 - 二氯靛酚在溶液中呈无色。,2，6 - 二氯靛酚的性质,67,（1）2草酸 （2）1草酸,仪器,植物组织捣碎机,试剂,（3）

25、0.1mg/mL Vc标准溶液,（4）2，6 - 二氯靛酚溶液 称取2，6 - 二氯靛酚50mg于烧杯中，加入200mL含52mg碳酸氢钠的热水中，待冷后置于冰箱中过夜，次日过滤于250mL棕色容量瓶中，定容。,68,标定：吸取Vc标准溶液l0mL于三角瓶中，立即用2，6 - 二氯靛酚溶液滴定至溶液呈浅红色，并且30s不褪色，记录消耗的2，6 - 二氯靛酚溶液的体积。 做空白实验。 计算出1mL 2，6-二氯靛酚溶液相当于Vc的mg数（T）。,69,称取洗净、擦干的新鲜果蔬一定量于植物组织捣碎机中，加等量的2草酸，捣成匀浆 称取匀浆1020g，用2的草酸35mL转移到100mL容量瓶中，最后用

26、1草酸定容，定容时若泡沫较多，可加12滴辛醇消除，摇匀，过滤，滤液备用。,操作步骤,（1）样品的处理,70,为什么在制备匀浆时用2%草酸，定容时用1%草酸？,因为2%草酸具有抑制抗坏血酸氧化酶的活性，而1%草酸没有。,71,吸取滤液10mL于三角瓶中，立即用2，6-二氯靛酚进行滴定至溶液呈浅红色，并且30s不褪色，记录消耗的2，6-二氯靛酚溶液的体积。,（3）空白实验,（2）样液测定,72,结果计算,X- Vc含量（mg/100g),73,1.操作要尽可能快，并防止与铁、铜器具接触。 2.草酸与样品提取液避免日光直接照射。 3.当样液具有颜色时可加少量白陶土脱色。,说明与注意事项,74,（二）

27、2，4 - 二硝基苯肼法,样品中还原型Vc经活性碳氧化为脱氢型Vc，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总Vc含量成正比，在500nm下进行比色测定。,原理,75,温水浴锅 可见-紫外分光光度计 植物组织捣碎机,仪器,76,试剂,（1）4.5mol/L硫酸,（2）硫酸（9：1）,（3）2% 2，4 - 二硝基苯肼,（4）1%草酸溶液,（5）2%草酸溶液,（6）1%硫脲溶液,（9） 1mg/ mLVc标准溶液,（7）2%硫脲溶液,（8）1mol/L HCl,（10）活性炭,77,（1）样品处理 称取一定量新鲜样品于组织捣碎机中，加入等量的2%草酸溶液，打成匀浆。取1020g匀浆，转入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液定容至刻度。摇匀，过滤，备用。,操作步骤,78,（2）氧化处理 吸取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去初滤液。吸取10mL此氧化液于三角瓶中，加入10mL2%硫脲溶液，混匀。,79,（3）显色反应 于三支试管中各加入4mL上述氧化液，其中一支试管作为空白，在另两支试管中加入1mL 2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放于370.5恒温水浴中保温3h，取出。,80,除空白管外，将所有试管放于冰水中。 空白管取出后，冷却至室温，而后加入1mL 2，4-二硝基