细菌总数与大肠菌群数测定.ppt

1、主要内容,细菌总数测定 总大肠菌群测定,第一部分 细菌总数的测定,测定方法、方法依据以及测定范围 测定原理 检测试剂、仪器设备 分析步骤 结果计算,注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识,一、测定方法：平皿计数法 二、 方法依据：生活饮用水卫生规范（2001） 三、测定范围 ：水中的细菌总数的测定,四、测定原理 细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异样菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存活的细菌总

2、数。,五、试剂 营养琼脂 （1）成分，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂10-20g，蒸馏水1000mL （2）制法，将上述成分混合后，加热溶解，调整pH值为7.4-7.6，过滤，分装于玻璃容器中，经121、103.42Pa高压蒸汽灭菌20min，贮存于冷暗处备用。,六、仪器设备 1、高压蒸汽灭菌器 2、干热灭菌箱 3培养箱361 4、电炉 5、天平 6、冰箱,7、放大镜或菌落计数器 8、pH计或精密pH试纸 9、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等,细菌总数测定,器材一览,七、分析步骤 1、水样的稀释 （1）以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐

3、水的试管中，混匀成1:10稀释液。,（2）吸取1:10的稀释液1mL注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000，1:10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1 mL灭菌吸管。,2、操作方法 （1）以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照,倾注培养,（2）待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于361培养箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1m

4、L中的细菌总数。,培养结果,（3）如果测定水源水 用灭菌吸管取23个适宜稀释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。,八、计算 1、菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。,在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。,2、不同稀释度的选择及报告

5、方法 1）首先选择平均菌落数在30300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之,2）若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数。 若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数。 若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。,3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀

6、释倍数报告之。 6）若所有稀释度的均无菌落生长，则以1乘以稀释倍数报告之。,7）菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。,第二部分 总大肠菌群数测定,总大肠菌群是指那些能在37C，48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。,总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法适用于各种水样（包括底泥），但操作复杂，需要时间长；滤膜法主要适用于杂质较少的水样，操作简单快捷,大肠菌群数测

7、定,注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种,实验原理 37 ，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气（小倒管） 三步法：初发酵、分离培养、复发酵 器材与试剂 水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基，革兰染液 吸管、试管、平皿、载玻片,初发酵,水样、无菌水、三倍乳糖蛋白胨，吸管、酒精灯、吸球,器材与试剂,大肠菌群数测定,实验步骤： 1.初发酵 （1）2个大试管（内有倒管），100ml水样+已灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（50ml） （2）10支试管（内有倒管），10ml水样+已灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（5ml） （3）培养：37

8、 ，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）,吸取水样,加注水样,初发酵结果,左2为阳性结果，培养基变成黄色（产酸），小倒管内有气体产生。,大肠菌群数测定,实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 37，24h,分离培养,器材与试剂 初发酵结果、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,分区划线法,分区划线法,操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在

9、平板上滑动,大肠菌群数测定,实验步骤 2.分离培养： （5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落,革兰染色法,器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,革兰染色法,涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s,涂片,热固定,初染,媒染,脱色,复染,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,复发酵,器材与试剂 培养24小时

10、后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,大肠菌群数测定,实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37，24h （4）观察指标：产酸，产气,液体接种,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表，报告每升水中的大肠菌群数,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数