2基因工程的主要技术原理

1、,Genetic Engineering,第二章 基因工程的主要技术原理,第二章 基因工程的主要技术原理,由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。,第一节 DNA的提取与纯化,大肠杆菌基因组DNA,一、质粒DNA的提取,plasmid DNA,The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,

2、闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1 .碱抽提法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1 .碱抽提法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,（2） 所用的试剂作用, 溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械

3、力（震荡）的作用而降解。,（2） 所用的试剂作用, 溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的NaAc有利于变性

4、的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。,用于沉淀DNA。, 乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。, NaAc-HAc缓冲液, RNase A,降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。, TE缓冲液,DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。, 酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒

5、；也可以自己配制。,（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”溶解细菌细胞壁。,第一步：溶菌,50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）,上清液中含有闭合质粒DNA

6、。,第四步：离心除去沉淀,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。,第五步：纯化DNA,上清液过柱或酚-氯仿抽提。,第六步：沉淀DNA,最重要的是：,2. 影响质粒DNA产量的因素,菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。,一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,（1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。,这是直接决定DNA产量的重要因素之一。,（3）质粒大小,分子量大的质粒，拷贝数少。,（2）质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定。,若干常用质粒的理论产量,若干常用质粒的理论产量,二、基因组或

7、其他DNA的提取,一般过程及原理：,1.细菌基因组DNA的制备,（1）细胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。,不用NaOH !,（3）沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇。,（2）DNA纯化,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。,一般过程及原理：,动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。,（1）组织粉碎,2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。,（2）细胞裂解,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,SDS是离子型去垢剂（deterge

8、nt），可以使细胞膜崩解。,（5）除去RNA污染,用RNase。,用2倍体积的无水乙醇。,（4）沉淀DNA,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）,一般过程及原理：,（1）组织粉碎,用液氮冷冻后研磨成细粉末。,3. 从植物组织中制备 DNA,（2）细胞裂解,用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65 oC温育。,用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,（4）沉淀DNA,（5）除去RNA污染,用RNase A。,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。,三、DNA的定量

9、和纯度测定,1. 紫外光谱法,DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。,用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。,原理：,蛋白质在280nm处有吸收峰,2,2,溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。,2. 琼脂糖凝胶电泳估计,原理：,与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。,一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。,DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,四、DNA分子量的估计,Marker,Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,

10、2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,DNA Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,DNA Marker,C Transcript levels of rice KNOX genes OSH1 a

11、nd OSH3 revealed by RT-PCR in leaves from wild-type (WT), phenotypic YAB3 RNAi (Y1 and Y2), and WOX3 overexpression plants (W1 and W2). Shoot apex mRNA was used as a positive control (S).,1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。,一、电泳的基本原理,

12、第二节 DNA的凝胶电泳,4.,如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。,摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。,Agarose gel electrophoresis Gel electrophoresis is not only us

13、ed as an analytical method, it is routinely used preparatively for the purification of specific DNA fragments. The gel is composed of: Agarose: for DNA fragments ranging in size from a few hundred base pairs to about 20 kb (Fig. 2.1). Polyacrylamide: for smaller DNA fragments.,Fig. 2.1 Electrophores

14、is of DNA in agarose gels. DNA bands have been visualized by soaking the gel in a solution of ethidium bromide (see Fig. 2.2), which complexes with DNA by intercalating between stacked base-pairs, and photographing the orange fluorescence.,Fig. 2.2 Ethidium bromide.,Agarose gel is a complex network

15、of polymeric molecules whose average pore size depends on the buffer composition and the type and concentration of agarose used., In any event, gel electrophoresis is frequentlyperformed with marker DNA fragments of knownsize, which allow accurate size determination of anunknown DNA molecule by inte

16、rpolation(插入). In addition to resolving DNA fragments of different lengths, gel electrophoresis can be used to separate different molecular configurations of a DNA molecule., Gel electrophoresis can also be used for investigating proteinnucleic acid interactions,based on the observation that binding

17、 of a protein to DNA fragments usually leads to a mobility reduction.,二 、琼脂糖凝胶电泳,1. 琼脂糖,2. 琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。,浓度高,空隙小,空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。,3.琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,1、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体

18、和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。,三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。,三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,其优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。,琼脂糖凝胶电泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理与装置,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用

19、下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,电泳方向,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,3、蛋白质电泳的分子量标准,Dalton,SDS PAGE,4、凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,四、凝

20、胶染色,1. 染料,溴化乙锭。,Ethidium bromide （EB）,EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。,2. 原理,UVP全自动凝胶成像分析系统,OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统,核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为D

21、NA印迹交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。,第三节 核酸的分子杂交,DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。,Southern 杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或

22、其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。,一、Southern blot,Southern blot,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,Southern blot 筛选结果,二、Northern blot,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。,主要检测插入片断是否被转录。,蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异

23、性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的

24、特异性目的基因表达的蛋白成分。,三、 Western Blot,Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白, Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清

25、洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。, Blotting过程,Immuno Blotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,四、 原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针。,3,第四节 基因 扩增技术-PCR,一、基因扩增（gene amplification),指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：,1. 环境诱发扩增,2. 基因的程序性扩增,5. PCR扩增,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,1. 环境诱发扩增,如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基

26、因扩增。,在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。,在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。,2. 基因的程序性扩增,如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。,5. PCR扩增,应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,（1）,1. PCR的发明,二、PCR技术,（2）,Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。,1985年Cetus公司的科学家K.B. Mull

27、is发明了PCR，使这一设想变成现实。,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。,当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。,Polymerase Chain Reaction,（3）Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。,（4）PCR 仪,1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。,1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。,PCR仪,

28、2. PCR技术的原理,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95oC,（1）DNA模板变性,模板,模板（template）,95oC,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,（2）DNA模板与

29、引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer）:,40-65oC,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,（3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72oC,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,（5）1个循环的结果,（4）新一轮循环开始,DNA elongation,3. PCR的过程,（1）第一步 变性（denature）,94-9

30、5 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。,（2）第二步 复性（anneal）,50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。, 引物的浓度高， 引物的链短。,94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。,（4）第四步 变性（denature）,72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。,（3）第三步 延伸（extend）,（5）第五步 重复（repeat）,第二步第三步第四步,复性,延伸,变性,95oC 5min,50oC 1min,72oC 2min,94oC 1min,温度循环,PCR仪的温度循环程序,PCR,需要的模板量极低。,4. PCR

31、的特点,（1）特异性强, PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。,（2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！,RT-PCR：,对模板的纯度要求低。,（5）可以扩增mRNA,（4）简便,先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。,（3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片

32、断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。,（1）Taq DNA聚合酶,5. 影响 PCR的因素,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。, 热稳定性,最适温度： 75-80 oC 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb, 最适温度高, Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/

33、L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。, Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,4,金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。, Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,4,（2）其它耐热的 DNA聚合酶,Tth DNA聚合酶,无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。,VENT DNA聚合酶,有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高

34、温。, Pfu DNA Polymerase, Taq Plus DNA Polymerase,有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。,但PCR产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。,是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。,Taq的PCR产物3端往往带有一个A。,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA。,（3）引物（primer),位置,3,3,即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11）。,引物的长度,理论计算：,419=2.751011。,一般引物设计为长1530bp。,引

35、物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。,template,primer,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列。,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）。,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCT

36、GCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,引物的Tm值,Tm=（G+C)4 + (A+T)2,当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于Tm值5oC。,手工计算：,一般估计：,引物的浓度,一般

37、使用终浓度各0.5mol/L。,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件,套嵌引物（nested primers),1,3,2,4,如Primer5.0等,Primer 5.0,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。,（4）模板（template), 模板的量：,不能太多，100l反应体系中100ng足够。, 纯度：,PCR对模板DN

38、A的纯度要求不高。,dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。,（5）dNTPs,一般反应体系中dNTPs混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。,Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。,（6）Mg 2+ 的浓度,所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。,借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。,6. PCR技术的扩

39、展,（1）荧光实时定量PCR,Realtime PCR（或TaqMan PCR ）,Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。,扩增两个引物外侧的未知序列,（2）反向PCR,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。,（3）不对称PCR,3,5,5,3,引物少,用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。,技术关键：,两个引物的浓度相差100倍。,

40、扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。,（4）反转录PCR（RT-PCR),Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖,技术关键：,利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq酶,PCR,Reverse transcription (RT),下游引物,上游引物,Taq酶,Fig. 3. RT-PCR analysis of Gbd 1 and Gbd 2

41、 in Pima 90 following infection by V. dahliae after 0, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 and 96 h, respectively. M: 100 bp DNA ladder. his-3 of cotton as the control.,7. PCR技术的应用,（1）扩增某一段DNA,从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列；,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（2）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入

42、突变序列。,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（2）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（2）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,设计引物定点诱变,利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。,（3）基因组的比较研究,比较不同物种之间的基因组特征和相似性。,类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性

43、DNA（RAPD）分析。,RAPD (Random amplified polymorphism DNA),1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：,当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。,第五节 DNA序列分析,（1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。,5,Sanger等1977年发明。,一、双脱氧链终止法,Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖,（1）DNA复

44、制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终 止。,1. 原理,（1）制备单链DNA模板,2. 技术要点,就是待测序的 DNA链。,不能有53和35的外切酶活性； 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。,（3）特殊的DNA多聚酶,dNTP / ddNTP = 100 / 1,（4）制备2和3双脱氧的ddNTP,时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。,需带有放射性或荧光标记。,（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）,3. Sanger双脱氧终止法测

45、序过程,模板序列,1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。,二、Maxam-Gilbert化学修饰法,Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖,末端放射性标记 的DNA片单链,长度只差一个核苷 酸的DNA链混合物,化学试剂处理,凝胶电泳,放射性自显影,阅读碱基顺序,特定的碱基中 引入化学基团,DNA在被修饰的 核苷酸位置断裂,1. 原理,2. 碱基特异的化学修饰法,3. 碱基特异的化学切割法,4. 测序过程,每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。,特点：,读出的序列就是要测的序列。,San

46、ger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。,测序读片,90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。,1. 原理,（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形 成完全的双链分子。杂交效率最高。,三、DNA杂交测序,（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。,（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。,8mer探针有48= 65536 种序列。,如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。,（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。,5-AGCCTAGC-3,Target,3-TCG

47、GATCG-5,Probe,假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。,但： 12mer靶DNA 与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。,3-TCGGATCG-5 3-CGGATCGA-5 3-GGATCGAC-5 3-GATCGACT-5 3-ATCGACTT-5,5-AGCCTAGCTGAA-3,12-mer target,8-mer probe,假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。,（1）DNA芯片（chip）,把寡聚核苷酸探针的3端或5端与玻璃或凝胶形成共价连接。 目前可以做出65536 种8-mer探针芯片。,2. 技术要点,每

48、种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。,DNA chip 杂交,（1）非放射性标记,1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。,四、DNA自动化测序,荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。,1. 技术要点,（2）不同的标记对象,既可标记引物，也可标记ddNTP。,（4）分析自动化,（3）读片的自动化,激光探头直接读胶，实时阅读。,（2）反应的自动化,Sanger脱氧终止法。,电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。,（5）反应可在一个试管中进行,标记ddNTP时。,2. 荧光标记引物的自动化测序,分别用4种荧光物标记引物， 区分反应产物， 混合电泳， 激光一次读胶

49、， 电脑合成结果。,3. 荧光标记ddNTP自动测序原理图解,4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP。,可在同一管中进行,可在单一泳道电泳。,荧光标记终 止法测序,测序结果,毛细管测序仪,日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！,标记法： 4色荧光、引物标记/终端标记。,测序长度： 600bp/毛细管,6,毛细管测序仪,日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！,标记法： 4色荧光、引物标记/终端标记。,测序长度： 600bp/毛细管,6,第六节 酵母双杂交系统,Yeast Two Hybrid System (Interaction trap),90年代

50、，纽约大学的S. Field等建立。,Constructed three set of test recombination Plasmids into yeast(双因子杂交系统),enhancer,1、双因子杂交试验：,Nothing,520 units,GAL4,GAL4-LexA,enhancer,Transcription-activating and DNA-binding domain of GAL4 can operate quite independently,Function of activation domain recruitment the RNA polymerase to promoter,Conclusion：,Different acidic activation domain may regulate different cis-factor targets,真核生物以多种