第9章-吸光光度法.ppt

1、分析化学,第九章 吸光光度法,返回,基本内容和重点要求,掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯比耳定律及摩尔吸光系数等知识； 了解比色分析和分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用； 学习显色反应和显色条件的选择； 理解分光光度法定量分析中的各种影响因素。,返回,第九章 吸光光度法,9.1 吸光光度法基本原理 9.2 光度计的基本部件 9.3 显色反应及显色条件的选择 9.4 吸光度测量条件的选择 9.5 吸光光度法的应用示例 9.6 紫外吸收光谱法简介,返回,9.1 吸光光度法基本原理,一、方法依据及分类 二、方法特点 三、光的基本性质 四、物质对光的选择性吸收 五、光的吸

2、收基本定律朗伯比耳定律 六、偏离比耳定律的原因,返回,一、方法依据及分类,基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外光度法及红外光谱法等。 比色分析法 通过目视比较颜色的深浅来测定物质的浓度。 吸光光度法 使用光度计测定的方法。,返回,二、方法特点,灵敏度高、选择性好 准确度较高 应用广泛 仪器简单、操作简便、分析快速,返回,三、光的基本性质,1、光的波动性和微粒性 2、电磁波谱图 3、单色光与复合光 4、互补色光,返回,1、光的波动性和微粒性,返回,2、电磁波谱图,返回,3、单色光与复合光,单色光：具有同一波长的光 复合光：不同波长组成的光 可见光的波长大约在400

3、760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。,返回,4、互补色光,如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光。,返回,四、物质对光的选择性吸收,1、物质对光选择性吸收的原因 2、物质颜色和吸收颜色的关系 3、双原子分子能级示意图 4、吸收光谱图,返回,1、物质对光产生选择性吸收的原因,光照射物质（或溶液）该物质的分子、原子或离子与光发生“碰撞”，光子的能量转移到分子、原子、离子上，使这些离子由基态跃迁到激发态，然后（10-8秒）又回到基态。以热、荧光等形式释放出来。 M（基态） + hv M*（激发态

4、） 这种作用叫做物质对光的吸收。但不是所有光能被物质吸收。因为不同物质微粒的结构不同，具有不同的量子化能级，其能量差也不相同，因此对光的吸收具有选择性。,返回,2、物质颜色和吸收颜色的关系,返回,表9-1 物质颜色和吸收颜色的关系,返回,以溶液为例：它是由于溶液中的粒子选择性地吸收某种颜色波长光而产生的。 若入射光都不吸收（即全部透过时）则溶液为无色透明； 若一部分波长光透过，其他波长光被吸收，则溶液为透过光颜色。也就是讲，溶液呈现颜色与吸收光颜色互补。 溶液颜色的深浅取决于溶液吸收光的量的多少，也就是取决于吸光物质浓度的高低。比色分析法的依据。,返回,有关固体物质颜色： 对白光全部吸收时，呈

5、黑色； 对白光全部反射时，呈白色； 对白光各波长吸收程度差不多时，呈灰色； 选择吸收某波长光，这时就由反射或透过光颜色决定。,返回,18,3、双原子分子能级示意图,返回,4、吸收光谱图,最大吸收波长max,返回,在可见光范围内对510nm附近绿色光吸收最大，对波长600nm光吸收最弱，几乎不吸收所以溶液呈橙红色。光吸收程度最大之处波长称之为最大吸收波长max。,返回,浓度不同，曲线形状相同，max不变，只是相应的吸光程度大小不同而已。 曲线形状与物质分子结构有关 吸收曲线为分析提供了依据； 在无干扰的前提下，一般选max为测定波长，有干扰时，则应根据干扰最小原则选A为最大的测定波长。,返回,五

6、、光的吸收基本定律朗伯比耳定律,1、透光度（率）与吸光度 2、朗伯比耳定律 3、吸光系数、摩尔吸光系数 4、吸光度的加合性,返回,1、透光度（率）T,透光率或透射比,返回,散射光强度,可见：T越大，说明对光的吸收就越小；反之则反。,2. 朗伯比耳定律,Lambert-Beers Law,A吸光度 K比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等有关 b液层厚度，cm c溶液的浓度，molL-1或g L-1,返回,公式推导：,设想：单色光通过溶液时是垂直照射，该溶液吸光物质为均匀非散射体系。 把有色溶液分成许多薄层各层厚度为db，其截面积为S； 各薄层中所含吸光物质质点数目为dn，每个吸光质点的

7、截面积为a，则此时薄层内所含吸光质点总截面积dS=adn；,返回,（接上）,设照射到该薄层上强度为I，由于吸光质点的吸收则光强度减弱了dI，它应与薄层中吸光质点的总截面积及入射光强度成正比即 -dI=K1I adn 设吸光物质浓度为，则薄层中吸光质点数目为dn=6.0231023cSdb 设6.0231023K1aS= K2，整理则得：,返回,（接上）,上式代入边界条件 积分：,返回,物理意义,当一束平行单色光，通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的A与溶液的浓度C，液层厚度b的积成正比。,返回,说明：,朗伯比尔定律是光吸收的基本定律，它的成立也是有前提的。 入射光为平行单色光垂直照射；

8、 吸光物质为均匀非散射体系； 吸光物质质子间无相互作用； 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和化学现象发生。 上面讨论的吸光物质为单一组分情况。,返回,3. 吸光系数、摩尔吸光系数,吸光系数a： 摩尔吸光系数（或）： 关系： （或 ） M a,返回,说明：,摩尔吸光系数是一个计算值。 值是物质的特征常数。它主要取决于、溶液性质、温度、仪器质量与b、c无关。 值大小表明了该物质对某波长光吸收能力大小。值越大，则吸光能力就越大，测定时灵敏度就越高。,返回,4. 吸光度的加合性,多组分体系中,返回,六、偏离比耳定律的原因,1、标准曲线（校正曲线） 2、偏离的原因,返回,又称工作曲线。,（一

9、）. 标准曲线（校正曲线）,返回,由曲线的斜率可求值。因b是固定的，=A/bc。又因值是多个标准溶液得到的平均值因此可靠。 求未知液的浓度。条件相同时Ax=bCx，Cx=Ax/b。应注意调节Cx大小使Ax在标准曲线范围内。,标准曲线的应用,返回,例 1,50mL比色管中，加入含有0.025mg的Fe2+溶液，加入邻二氮菲显色剂，用水稀释至50mL，用2cm比色池，在分光光度计上测得吸光度A=0.190，计算摩尔吸光系数？ 解：,返回,返回,（二）偏离原因,1、物理因素 非单色光引起的偏离： 目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一较窄波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而

10、导致对朗伯比耳定律的偏离。,返回,设两种单色光1、2，强度均为100个单位，分别通过浓度为c，液层厚度为b的溶液。再将1、2混合通过浓度为c，液层厚度为b的溶液，情况如何？其T、A值是否符合朗伯比尔定律。,返回,从数据角度考虑：,设：入射光由1和2组成，其强度分别为I0、I0，通过有色溶液，浓度为c厚度为b，此时透过光的强度为I1、I2。,返回,当两波长相差小时，此时视1=2，即入射光近似认为是单色光，A与C仍有线性关系；当两波长相差大时，则12，A与C就不成线性关系，发生负偏离。 克服非单色光引起的偏离的措施： 使用比较好的单色器； 人射光波长选择在被测物质的最大吸收处； 测定时应选择适当的

11、浓度范围。,返回,非平行入射光引起的偏离：这里指的是入射光不能保证全部垂直通过吸收池，此时导致光束平行光程b大于吸收池厚度b。使实测的吸光度大于理论值，从而产生正偏离。 介质（溶液）不均匀引起的偏离：指荣也不均匀，如产生胶体或浑浊，当入射光通过溶液就会发生散射，是透过光强度减弱，吸光度增大产生正偏离。,返回,2. 化学因素引起的偏离,浓度过高引起的偏离：浓度过高，吸光物质粒子间距离减小，它们之间的相互作用改变了吸光微粒的电荷分布。从而改变了它们对光吸收能力，改变了值，由值不恒定就改变了A与C的线性关系从而造成偏离。,返回,平衡效应：有些有色物质在溶液发生缔合、离解，同溶剂反应，产生互变异构体，

12、光化分解等平衡效应改变了吸收曲线的形状lmax，吸收强度等发生了变化，从而导致偏离。 如：Cr2O72- + 2H2O 2HCrO4- 2H+ + 2CrO42- lmax =350nm lmax=375nm 当用水稀释时平衡向右移动，就会使Cr2O72-工作曲线弯曲。,返回,化学反应引起的偏离：,酸效应：溶剂效应，也会使工作曲线弯曲。 在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比耳定律的偏离。,返回,9.2 光度计的基本部件,一、光度计的基本部件 二、吸光度的测量,返回,一、光度计的基本部件,光源 单色器 吸收池 检测器 显示装置,返回,1、光源,

13、在可见光区，常用钨灯或碘钨灯作光源，它们辐射3202500nm波长的光； 在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射180375nm波长的光。 具有足够的光强度，并能稳定。,返回,2、单色器,滤光片由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。 棱镜用光学玻璃或石英制成，光通过棱镜发生折射而色散。 光栅光通过光栅发生衍射和干涉现象而分光。,返回,3、吸收池,也称比色皿，用于盛吸收溶液； 由无色透明的光学玻璃或石英制成； 液层厚度为0.5、1、2、3cm等的一套长方形比色皿。,返回,4、检测器,接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。 硒光电池

14、或光电管或光电二极管阵列作检测器，检流计或毫伏表作读数装置。,返回,硒光电池：,作用原理是物理学中的光电效应。 当光照到光电池上半导体Se表面就有电子逸出收集于金属膜，因此带负电。由于半导体硒的性质，电子只能单向移动，是铁片成正极，通过电阻小的外线连接可产生电流。 此时就可以用检流计测。电流强度与照射光强度成正比。,返回,5、显示系统,把放大的信号以吸光度A或透射比T的光度分析法的设计方式显示或记录下来。 分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。,返回,双光束紫外分光光度计,返回,二、吸光度的测量,吸收池对入射光的吸收、反射及溶剂对入射光的吸收、散射。因此操作时就应选用光学性

15、质相同的两个比色皿，分别装待测物及参比溶液（不含待测物，其他与待测物溶液一样）。 分析分光光度中的检流计：检流计有2种刻度T%和A。,返回,分析分光光度中的检流计：,返回,操作：,调整仪器的机械零点。看检流计T=0，A=这一点； 以参比溶液调节吸光度的零点，又称工作零点。看检流计T=100%，A=0这一点； 测待测物溶液的吸光度。 实际上是把通过参比溶液吸收池的光作为入射光的强度。也就是：,返回,9.3 显色反应及显色条件的选择,一、显色反应 二、显色反应的选择 三、显色条件的选择 四、显色剂,返回,一、显色反应（ Color reaction ）,待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质

16、是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。 按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。,返回,二、显色反应的选择,灵敏度高，有色物质的应大于104； 选择性好，干扰少，或干扰容易消除； 有色化合物的组成恒定，化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定； 显色剂在测定波长处无明显吸收，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差（称为对比度）大于60 nm。,返回,三、显色条件的选择,1、显色剂用量 2、酸度 3、显色温度 4、显色时间 5、干扰的

17、消除,返回,1、显色剂的用量,M + R = MR （被测组分） （显色剂） （有色络合物） 为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。 在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。,返回,例如：,用SCN-测Fe3+ ： Fe3+ + SCN- = Fe(SCN)n3-n n=1-6 SCN-小时： Fe(SCN) 2+ SCN-=0.1mol/L： Fe(SCN)2+ SCN-0.2mol/L：Fe(SCN)3 Fe(SCN)4- 可见要严格控制用量问题。,返回,返回,如何求得最佳用量呢？,固定被测组分浓度和其他条件分别加入不同

18、用量的R测定吸光度作A-CR图，进行确定R的用量。此做法一般会出现以下三种情况： 情况2要严格控制R用量；情况3是由于高配位化合物颜色越来越深,2、酸度,1）影响显色剂的浓度：显色剂大多为有机弱酸或弱酸根。 HR = H+ + R- + M = MR 可见它影响HR离解以致显色反应不完全。 2）对显色剂颜色的影响：许多显色剂在不同酸度下有不同的颜色。,返回,3）对配合物组成和颜色的影响：这里主要是针对能形成逐级配合物的显色反应。 4）酸度控制不妥会造成待测金属离子水解，确定最佳酸度通常是固定被测组分、显色剂浓度及其它试剂浓度，改变pH测定A，作ApH图。,返回,3、显色温度,显色反应大多在室温

19、下进行，有些显色反应需加热至一定温度完成； 有些有色物质温度偏高时易分解； 通过实验，作出 AT图，求最佳温度，即找出平坦区。,返回,4、显色时间,有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变； 有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色； 有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定； 制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。,返回,干扰的消除,用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰； 选择适当的波长； 当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰； 分离：以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。,返回,5. 干扰的消除

20、,干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰； 干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰； 干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。,返回,干扰的消除,控制溶液酸度（酸效应）； 加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子形成无色络合物或无色离子； 利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态； 利用校正系数；,返回,四、显色剂,1、无机显色剂 2、有机显色剂 3、多元络合物,返回,1. 无机显色剂,无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高，目前应用不多。 如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵

21、显色测硅、磷和钒等。,返回,2. 有机显色剂,有机显色剂分子中含有生色团和助色团。 生色团（chromophoric group）： 含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的可见光而显色。 助色团（auxochromic group）： 含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。助色团与生色团的不饱和键作用，使颜色加深。,返回,常用有机显色剂,磺基水杨酸： OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。 丁二酮肟： NN型螯合剂，用于测定Ni2+。 1,10-邻二氮菲： NN型螯合剂，测微量Fe2+。,

22、返回,3、多元络合物,多元络合物 三元络合物 离子缔合物 金属离子络合剂表面活性剂体系 杂多酸,返回,二苯硫腙： 含S显色剂，萃取光度测定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等。 偶氮胂(铀试剂)： 偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th()、Zr()、U()等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。 铬天青S： 三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。 结晶紫： 三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。,返回,上一页,下一页,退出,多元络合物,由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。,返回,三元混配络合物,金属

23、离子与一种络合剂形成未饱和络合物，然后与另一种络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简称三元混配络合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。,返回,离子缔合物,金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。 如：Ag+与1,10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。 作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等；作为阴离子，有

24、X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和某些酸性染料等。,返回,金属离子络合剂表面活性剂体系,金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动（红移），而测定的灵敏度显著提高。目前，常用于这类反应的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵 、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH89时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定。,返回,杂多酸,溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸

25、光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。 杂多酸法需要还原反应的酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。,返回,9.4 吸光度测量条件的选择,一、入射光波长的选择 二、参比溶液的选择 三、吸光度读数范围的选择,返回,一、入射光波长的选择,“最大吸收原则”（maximum absorption） 不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离。 “吸收最大、干扰最小” 在最大吸收波长处有

26、其他吸光物质干扰测定时选择。,返回,返回,二、参比溶液的选择,参比溶液的作用： 调节仪器零点，消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰。 除此外它还可以抵消其他因素的影响。例如所用的容器、试剂、环境带进的被测成分；显色剂的颜色；方法本身无法掩蔽的其它组分颜色等等。,返回,二、参比溶液的选择,参比溶液的选择原则： 1、如果仅待测物与显色剂的反应生成物有吸收，即试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。 2、显色剂R或其它试剂有吸收试剂空白作参比。(即不加试样的溶液) 3、如试样中其它组分N有吸收，但不与R反应，且R无吸收时可选试样溶液作参比。 4、如试样中其它组分有吸收，但不与显

27、色剂反应，显色剂有吸收则应加入掩蔽剂将待测组分掩蔽后加显色剂作参比。,返回,三、吸光度读数范围的选择,推证，设试液服从朗伯比尔定律： 式中 为浓度的相对误差， 为透光度的绝对误差。对于一定的仪器而言， 为一常数，一般的分光光度计的 约在0.2%2%（令 T=0.5%）,返回,当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在0.20.8之间，才能保证测量的相对误差较小。,返回,上一页,下一页,退出,9.5 吸光光度法的应用示例,一、试样中微量组分的测定 二、常量组分的测定 三、光度滴定 四、酸碱离解常数的测定 五、配合物组成及

28、稳定常数的测定 六、双波长分光光度法,返回,一、试样中微量组分的测定,1、单组分的测定 例如：测定某一生物流体中Ca2+含量。 第一步：选择合适的显色剂、参比溶液 可选偶氮砷（），它与Ca2+形成紫色1：1配合物。由于Ca2+无色，偶氮砷有色，故选偶氮砷作参比溶液。,（接上）,第二步：选择合适的测定波长：590nm 第三步：绘制工作曲线：首先要以最佳吸光度读数范围（0.151.0）确定浓度即A=bc，配制标准系列溶液，测吸光度，作AC曲线。 第四步：测定试样中的A值：由工作曲线找出对应的浓度。,2、多组分分析：根据吸光度具加和性的特点 三种情况：互不干扰；一种干扰、互相干扰。 测定时注意：对于

29、两种组分或以上组分测定它是有条件的，被测组分必须互相不起化学反应；每一种组分必须在某一波长范围遵循朗伯比尔定律。,二、常量组分的测定示差分光光度法,1、引入示差法的原因 常量组分测定时，准确度要求高，一般为0.1%，但光度分析2-5%只宜于微量组分测定；高浓度溶液大多不遵守朗伯比尔定律，工作曲线弯曲；浓度大时，A值超过了宜读数范围，引入了较大误差。 2、定义：使用浓度稍低于试液Cx的标准溶液Cs作参比，以代替一般光度法所用的参比溶液的一种方法。,3、示差法原理 设作参比溶液的标准溶液浓度为Cs，被测试液浓度为Cx，且CxCs 依定律：Ax=bCx As=bCs 两式相减：AxAs=b（CxCs

30、） 即： A=b C 可见，用已知浓度的标准溶液作参比溶液测得A值是被测试液与参比溶液的吸光度之差，是一个相对吸光度， A与 C是成正比的。,4、提高分析结果的准确度的原因 1）从检流计标尺上去分析：例如，按一般光度法以无色溶液作参比溶液测得标准溶液Ts=10%，试液Tx=5%；改用示差法，将标准溶液作参比溶液使Ts=100%，就必须增大光源强度因此试液Tx也就相应增大到50%，这样就等于把标尺扩大了10倍。,2）从测量时的相对误差分析 一般分析 ：E为x%，被测物为Cx，则产生误差Cx（x%） 示差法： 测量被测物浓度为 C，则产生误差 C 因为Cx C，所以示差法误差较小，提高了方法的准确

31、度。,三、光度滴定,光度测量的方法来确定滴定终点的方法。 主要用于平衡常数较小或无合适指示剂的滴定分析。 测定滴定过程中溶液的吸光度并绘制滴定剂体积和对应吸光度曲线（A-V）根据曲线确定滴定终点。,四、酸碱离解常数的测定,研究酸碱指示剂及金属离子指示剂的重要方法之一。 若在可见光区无吸收时（即无色），则可用紫外或近红外光度法进行测定。 原理：HL = H+ + L- 若HL=L-，则pH=pKa 可见：HL与L-受pH值影响；只要找到HL=L-之点就可以求Ka值；如果是多级离解，只要吸收光谱曲线不重叠就可以求出各级离解常数。,2、方法 1）首先配制一系列总浓度相等而pH不等的溶液； 2）用酸度

32、计测定各次的pH值； 3）选定酸态（HL）、碱态的最大吸收波长，用1cm的吸收池测定各溶液的吸光度； 4）计算Ka值。,（接上）,根据吸光度的加和性原则， A = HL HL + L- L- 式中HL、L-用分布系数与总浓度表示，即可以表示为： 在高酸度时：C=HL 则A HL = HLC 在高碱度时：C=L- 则A L-= L- L-,代数法求一元弱酸离解常数,（接上）,合并三式得： 取对数： 式中A L-、A HL分别为弱酸完全为L-、HL时的吸光度，A为一定pH值时的吸光度。 也可以用作图法求解。,五、配合物组成及稳定常数的测定,连续变化法、斜率比法、平衡移动法 1、摩尔比法 (又称饱和

33、法)的依据：在配位反应中，金属离子（M）被显色剂（L）所饱和的原则来测定配合物组成。 2、具体作法： 例如：M + Ln = MLn M、L均不干扰MLn的吸收,（接上）,1）依摩尔吸光系数（）值估计配制CM =CL=10-4-10-5mol/L标液测得吸光度，看是否在读数范围之内A（0.15-1.0）T（10-70%）； 2）在一定条件下配制一系列溶液，固定CM，改变CL浓度，使CL /CM比值在0.1-10之间； 3）分别配制含同量的试剂参比溶液； 4）分别测定吸光度； 5）作图：以A为纵坐标，CL /CM为横坐标。,3、形成常数的测定 上述摩尔比法就可用于形成常数的测定。如1：1型配合物

34、。 根据物料平衡：CM = M + ML M= CM ML （1） CL = L + ML L= C L ML （2）,（接上）,若金属离子和配位剂在测定波长处无吸收（设b=1cm），此时： A = ML 即ML= A / 按曲线的最高点（A最大恒定值）处，计算ML的摩尔吸光系数 = A0 /ML （3）,（接上）,将（1）（2）（3）代入形成常数式：,六、双波长分光光度法,1、原理： 使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度

35、高。被广泛用于环境试样及生物试样的分析。,（接上）,A与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。,2、应用 1）混浊试液中组分测定 ：一般选择待测组分的最大吸收波长为测量波长(l)，选择与其相近而两波长相差在4060 nm范围内且有较大的A值的波长为参比波长。 2）单组分的测定 ：进行单组分的测定，以络合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长；以有色络合物吸收曲线下端的某一波长作为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。,（接上）,3）两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是：待测组分在两波长处的吸光度之差A要足