冰冻切片实验步骤

1、全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4 冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片48m，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3次。用3%过氧化氢孵育510分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗？冰冻切片不能用热修复啊！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，PBS洗，5分钟2。2 510正常山羊血清（PBS

2、稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。3 PBS冲洗，5分钟3次。4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟3次。5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1030分钟。6 PBS冲洗，5分钟3次。7 显色剂显色（DAB）。8 自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片48

3、mm，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟2。 下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片48um，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟2。2 510正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。3 PBS冲洗，5分钟3次。4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），3

4、7孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育1030分钟。PBS冲洗，5分钟3次。5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1030分钟。6 PBS冲洗，5分钟3次。7 显色剂显色（DAB或AEC）。8 自来水充分冲洗，复染，封片。1. 冰冻切片4um左右，室温25C复温30min，浸入4C预冷的丙酮固定10min，2. PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3. 用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条

5、件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。4. PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。5. 5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6. 甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。7. 配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工

6、作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。8. 放入湿盒内，置于4C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。9. 第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10. 滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。11. 滴加1:1

7、00比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。12. DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13. 终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附着。14. 甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，

8、直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。15. 水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜16. 封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1. 单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动

9、玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。2. 双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重复涂胶1次600C烤干,备用。我用过的尼氏染色的方法，效果不错。1 溶液配制：(1) 溶液A：焦油固紫0.2g, 纯水500ml(2) 溶液B：0.1M冰醋酸 冰醋酸3ml， 纯水500ml(3) 溶液C：0.1M无水醋酸钠 无水醋酸钠4.1g，纯水500ml(4) 溶液D：PH3.54.5醋酸缓冲液 B液94mlC液6ml(5) 工作液：A液10mlD液90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避

10、光操作，可以用黑色塑料袋罩着。2 具体步骤： 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤开始；如果为冰冻切片，从步骤开始。 将凉干的切片放入纯水中35min。 切片放入焦油固紫染色液中11.5h。 切片放入纯水中洗去浮色。 切片放入708095的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。 切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。 切片放入100乙醇，5min3次；二甲苯5min3次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配

11、制：甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染1020分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染2分钟（6）水洗（7）脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色， 冰冻切片脱脂问题：0.5盐酸乙醇分化液 配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感

12、性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。试剂与仪器l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l 荧光显微镜l 玻片架l 滤纸l 37温箱等。实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，

13、使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对

14、照显示为（）或（-），即可判定为阳性。注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25左右），高于37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较3730 min效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1） 标本自发荧光对照：标本加

15、1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工

16、作浓度确定3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和补体法） http

17、:/cyh(2010-07-28 11:23:08)-为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时设置对照：1、直接法 （1）标本自发荧光对照标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。 （2）抑制试验可分为一步方法和二步方法。一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。（3）阳性对照用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。2、间接法（1）自发荧光对照：同直接法。（2）荧光抗体对照：标本只加间