液质联用技术的原理及在药学研究中的应用PPT参考课件.ppt

1、,液质联用的原理及在药学研究中的应用,张明 Ph.D 2016.08,北京润德康医药技术有限公司,1,目录,一、液质联用的原理 二、液质联用的应用,2,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,LC: 液湘色谱仪 一种能够把液体混合物中的不同组分根据在色谱柱中保留时间不同进行分离,检测及收集的仪器 MS: Mass Spectrometer 质谱仪 一种能够把分子转化生成带电离子,并在气态中根据质荷比(m/z : m质量 z分子所带电荷数 )的不同把离子进行分离并进行检测的仪器.,一、液质联用的原理,3,V. Ramachandran Ph.D. D

2、issertation Defense,液质联用的原理,液质联用(LC-MS)：不挥发性化合物分析测定，极性化合物的分析测定，热不稳定化合物的分析测定，大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定,4,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,用液相或注射泵将样品注 入质谱.,1. 样品注入,系 统 组 成,5,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,连续注射 样品放在注射器中或静态的针内 用注射泵或电场引力, 样品流连续并恒定地流入离子源喷口 通常用于安装时调谐, 质量校正 和标准样品质谱方法的

3、优化 流动注射分析 用手动进样器和液相泵,注入样品,由流动相带入离子源喷口 通常安装5ul的定量环 液质联用 用液相的泵,流速从 nL/min 到 mL/min 样品可能是纯品或者是混合物 流动相带着样品经过色谱柱分离后进入质谱的离子源,1、样品注入,6,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,2、离子源,大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）ESI为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大的样品效果好一些；APCI为大气压力化学电离源，样品先

4、形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好。APPI：大气压光电离源，适用于弱极性的化合物，如多环芳烃等,7,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,2.1 ESI离子源,ESI为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大的样品效果好一些； 电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。目

5、前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质,8,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好。 有些分析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子，所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子，主要是准分子离子。,2.2 APCI离子源,9,

6、V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；,10,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,大气压电喷雾质谱应用范围,大气压电喷雾源,大气压化学源,分子量,化合物极性,1000,100,000,10,000,非极性,极性化合物,气相色谱/质谱,11,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,3、 质量分析器-四级

7、杆（quadrupole mass spectrometer）,四极杆的工作原理,不稳定的离子,稳定的离子,离子源,检测器,直流和交流控制电信号,12,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,RF only-A rods & B rods are 180 out of phase 只加交流信号-A杆与B杆上 加的电压强度相同,相位差180度,13,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,四极杆的工作原理RF+DC,14,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense

8、,15,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,离子在四极杆中的稳定性,16,4、 离子检测 MS/MS, 必须通过连续放置多个分析器来实 现空间串联的多级质谱分析。 对于QQQ，每个分析器有以下单独的作用： 第一个四极杆(Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离 子。 第二个四极杆(Q2) ，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等。 第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。,17,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,三重四极杆基本功能,

9、,Q1 可以筛选母离子 mz1 Q2 通过碰撞碎裂打碎离子，形成碎片离子峰 Q3 筛选子离子，定量子离子碎片强度 mz2,18,三重四极杆工作模式,模式 Q1 扫描,Q1 扫描离子,Q2 不打碎，传输,Q3 无分辨，传输,用途和特点 了解样品基本,信息,子离子扫描,固定过滤母离子,打碎母离子,扫描子离子,研究母离子的结 构特征,母离子扫描,扫描母离子,打碎母离子,固定过滤子离子,筛选具有特征子,离子（结构）的,分子,中性丢失 单离子监视 SIM 多反应检测 MRM,扫描母离子 按表过滤离子 按表过滤母离子,打碎离子 不打碎，传输 打碎母离子,扫描子离子，与 母离子有特征差 异 无分辨，传输 按

10、表过滤子离子,筛选具有特征结 构的分子，此结 构不易形成子离 子 定量 定量，假阳性低,19,QQQ多级质谱：子离子扫描, Q1选择了某一特定质量的母离子，Q2碰撞池产生碎片离子，然后在Q3中分析。此过程产生典型的质谱质谱碎片谱图。,第一个四极杆在选择性离子监测模式，第二个在全扫描监测模式,20,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,QQQ多级质谱：母离子扫描, 在母离子扫描中，Q1测定母离子，Q3测定某个特定的碎片离子，因此可在非常复杂的混合物中监测某种特定的分子。 在下面的例子中，睾丸激素在母碎片（m/z 367）中碎片m/z 97得到选择性

11、监测，具有极高的灵敏度和精确的定量分析。,21,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,QQQ多级质谱：中性丢失扫描,在QQQ中进行中性丢失扫描，Q1和Q3分析器的结合使灵敏度 和选择性得到最大化。Q1/Q3中性丢失扫描可监测母离子特定的中性丢失，例如缩氨酸磷酸盐中一个磷酸根的丢失。在这个例子中，Q1和Q3的扫描得到母离子的谱图，这张谱图是母离子为了磷酸化，丢失了碎片98而得到的,22,QQQ多级质谱：单个反应监测(SRM),选择某一质量的母离子，Q2碰撞单元产生碎片离子。Q3只分析一个碎片离子。此过程产生一个简单的单个离子碎片谱图,23,V. R

12、amachandran Ph.D. Dissertation Defense,QQQ多级质谱：多反应监测,Q1选择某一质量的母离子，碰撞单元产生碎片离子。Q3用于搜寻多个选择反应监测，这就是多重反应监测（MRM）。,24,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,MRM 假阳性率较低的原因, ,利用母离子和子离子的共同特征，定量选择性提高 例如：, ,如果样品 A 母离子 697 和样品 B542 在打碎后都具有子离子 245 如果直接以特征离子 245 定量 A697 ，那么样品 B 就会对样品 A 的定量造成干扰 而利用离子对 697-245 定

13、量， B542 在 A697 通过 Q1 时无法通过 Q1 ，这样就排除了 B542 的干扰,697,EI,245 542,25,三重四极杆与其他液相/质谱联用技术的比较, 在质谱应用领域里三重四极杆是最灵敏和定量重现性最好 的仪器。 在质谱应用领域里三重四极杆在执行中性丢失扫描和母子扫描模 式具有最好的灵敏性和准确性。 三重四极杆不是最好的获取质谱图的仪器，平行测量的质谱系统 会更好些： 三重四极杆质谱/质谱不如离子阱质谱仪（ TRAPS ）灵敏（定性） 三重四极杆质谱不如飞行时间质谱仪（TOF）所获取的质谱图那么 有说服力（定性）,26,V. Ramachandran Ph.D. Diss

14、ertation Defense,二、LC-MS/MS应用,高效液相色谱分离化合物范围广泛，准确度高，对化合物破坏性小。 质谱灵敏度高，对未知化合物的结果分析定性准确，对被测定化合物和形影标准样品的了解要求较低。 将HPLC的高效分离能力与MS高专属性高灵敏度检测功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定性和定量分析。,27,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,28,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,优点： 测定准确分子量，其他技术无法比。 灵敏度高，常规10-710-8g，单离子检测可达10-

15、12g 分析速度快 便于分离、分析混合物其他技术无法胜任 广泛适用于各类化合物 局限性： 异构体、立体化学区分能力差 重复性差，需专人操作 离子源产生记忆效应、污染等。 价格贵，操作复杂，实验环境要求高。,29,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,医药学：药物代谢、药动学、杂质分析、天然产物分析 生物化学：多肽、蛋白质、核酸、糖 环境化学：农药、农残分析、有机物污染、土壤/食品/水分析 临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白、血红蛋白变异、胆酸 食品科学：香料、添加剂、包装物、蛋白质、致癌物 法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测 化学：合成、表面活

16、性剂、染料,30,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,在药品研发中的应用,药物研发、生产过程中，微量杂质和副产物的定性鉴定。 潜在基因毒杂质的定量分析。 LC-MS分析条件的选择考虑两个因素： 1、使分析样品得到最佳分离条件 2、得到最佳电离条件以获得更好的灵敏度 当进行单离子检测时，如果没有介质效应，不用将物质完全分开便可以检测，这样既减少了分析时间，也可以降低分析难度，尤其是在进行大量体内药物分析时可以考虑。,31,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,影响LC/MS测定的因素,pH影响 检测

17、正离子，酸化样品 检测负离子，碱化样品 常用的pH调节溶剂 乙酸 pH 34 甲酸 pH 23 三氟乙酸 pH 12 氨水溶液 甲酸铵 乙酸铵,32,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,溶液和缓冲剂的组成,ESI离子源 APCI源以上均可用 不适合：不挥发性盐：磷酸及盐、硼酸及盐、氯化钠、十二烷基硫酸钠、强离子对试剂等,33,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,样品浓度的影响,样品浓度过低：检测不出 样品浓度过高： 污染离子源、仪器管路（特别是表明活性剂） 产生簇离子或多聚体-谱图复杂化 产生空

18、间电荷效应-谱图歧变,34,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,2、基质效应,基质效应（matrix effect）是由于样品中存在干扰物质，对响应造成直接或间接的影响。LC-MS分析时，内源性物质使待测物的离子化效率降低或者增强。 产生原因：待测组分与样品中基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争。结果显著的降低或增强目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确度。使得信号的响应值产生较大变异。,35,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,LC-MS分析时基质效应客观存在，并随样品不同

19、而不同。影响基质效应的因素很多，如样品、基质、样品前处理过程、色谱条件、色谱分离效果、流动相、离子化等。 优化色谱条件 改进前处理方法纯化样品 改变离子化方式 内标定量法,36,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense,样品前处理,过滤 （0.45um滤膜）、超滤（3K、10K、30K等） 溶剂萃取（去除杂质Na+、K+等） 高速离心（去除不溶物） 透析（常用于蛋白纯化、除盐） 固相萃取（除杂质、盐、浓缩样品、更换溶剂等） 分子筛（常用于蛋白纯化） 色谱分离（正相、反相、亲和）,37,V. Ramachandran Ph.D. Dissertation Defense