第35章 dna的重组与基因工程

1、DNA的重组与基因工Chapter35程Genetic recombination？基因重组与基因工程Chapter35 DNA的重组与基因工程基因重组(geneticrecombination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译。一、DNA的重组的分类同源重组、特异位点重组和转座重组等类型二、自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的程Chapter35 DNA的重组与基因工二、自然界的基因转移和重组1、结合作用结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）2、转化及转导作用（1）转化作用transfor

2、mation通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程（2）转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径座溶原菌途径3、转2、转化及转导作用（2）转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径溶原菌途径溶原 裂解3、转座转 座反向重复序列由可移动的DNA序列（插入序列和转座子）介导的基因移位或重排插入序列转座保守性转座反向重复序列转座子转座复制性转座转座酶转座子可以从一个染色移至另一位点的分散的重复序列点转程Chapter35 DNA的重组与基因工二、自然界的基因转移和重组4、基因重组不同DNA 分子间发生的共价连接称重组（一）位点特

3、异的重组特异位点（二）同源重组同源序列间的重组程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术19731978Cohen第一例成功的克隆实验Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用1985中国第一批转基因家畜（兔、猪和羊），转基因鱼程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术n 1993n 1997n 1999.9基因工程西红柿在美国上市英国罗斯林研究所多莉羊中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%n 2000.6.26n 2001.2.11科学家公布人类基因组工作草图公布

4、人类基因组基本信息n 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术（一）重组DNA技术的相关概念1、DNA克隆克隆（clone）无性繁殖分子克隆(DNA克隆)应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提 取获得大量同一DNA分子拷贝

5、，或其表达产物。基因克隆、DNA重组、基因工程(geneticengineering)n 基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿主细胞已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达重组体（一）重组DNA技术的相关概念2、工具酶常用的工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（一）重组DNA技术的相关概念限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系限制性核酸内切酶识别特异的位点酶切位点甲基化酶Eco R46bp回文结构GAATTCCTTAAG出现两种末

6、端粘性末端平头末端配伍末端粘端平端Smal CCCGGGGGGCCC（一）重组DNA技术的相关概念3、目的基因targetDNA目的基因（外源基因）cDNA基因组DNA逆转录基因工程的目的目的基因拷贝基因表达产物克隆载体表达载体（一）重组DNA技术的相关概念vector4、基因载体自我复制克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（，M13） 真核载体：动物病毒载体pLXSN质粒存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒1.拷贝数多;2.两三个抗药性基因筛选标志terrampr3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）Eco RHind Bam H氨苄青霉素抗性基因S

7、al Pst 四环素抗性基因pBR322Ava O r iPvu 程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术基本原理（一）目的基因获得1、化学合成法2、基因组DNA基因组DNA文库存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合3、cDNAcDNA文库4、聚合酶链式反应PCR程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术基本原理(二)克隆载体的选择和构建(三)外源基因与载体的连接（DNA连接酶） 连接方式1. 粘性末端连接相同酶切末端配伍末端连接效率高2.平端连接连接效率低3. 同聚物接尾法4. 人工接头法重组DNA技术简图载体DNA目的基因+dGTP+d

8、CTP3333PolyCPolyG程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术基本原理(四) 重组DNA导入受体菌基因工程菌转化制备感受态细胞HB101,JM109冷的氯化钙处理细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术基本原理(五)重组体的筛选1. 直接选择法screening/selection抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补互补分子杂交蓝白斑筛选探针原位杂交 /Southern印迹法限制性酶切图谱/PCR2.非直接选择法免疫学方法程Chapter35 DNA的重组与基因工三、重组DNA技术基本原理(六)克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件子通用1 、原核表达体系原核表达载体的标准n 合适的筛选标志n 强启动子n 翻译控制序列n 多克隆位点程Chapter35 DNA的重组与基因工四、重组DNA技术与医学的关系分子医学 molecular medicine（一）疾病基因的发现（二）发展生物制药基因工程药物基因工程疫苗（三）DNA诊断基因诊断基因诊断用分子生物学的技术对引起疾病的原因-遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞 遗传基因的检测和分析.DNA/RNA程Chapter35 DNA的重组与基因工四