生物化工工艺学--第2章--工业微生物基础下

1、,第三节 工业微生物菌种的分离和选育,获得菌种的途径：,（1）向菌种保藏机构索取有关菌株。国内：工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） ；中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） 。国外：美国典型菌种保藏保藏中心（ATCC）；日本大阪发酵研究所（IFO）等。 （2）从自然界中筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株。,工业化生产对微生物菌种的要求：,（1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需代谢产物，产量高。 （2）可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵。 （3）生长速度和合成速度较快，发酵周期短。 （4）选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易

2、感染噬菌体。 （5）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。 （6）菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。 （7）菌种应在短期内（最好3天或更短）生产出目的产物。,一 微生物菌种的分离,从自然界分离新菌种的一般步骤: 采样富集培养纯种分离性能测定,1 采样,（1）主要依据所筛选的微生物生态及分布概况，综合分析决定采样地点。 一般可从土壤中分离菌种。土壤中细菌最多，其次是放线菌和霉菌。一般较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在土壤中数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量较多。,1）加蜜饯、糖果、蜂蜜环境的土壤中-耐高渗透压的酵母菌、

3、柠檬酸产生菌、氨基酸产生菌等,2）食品加工厂、饭店等的污水中常含有淀粉-淀粉酶产生菌,3）热带森林的腐叶烂草下的土壤-产纤维素酶的微生物,4）从油田的浸油土壤中-有利用石蜡、芳香烃、烷烃的微生物,5）从白腐态树木中-可分离出分解木质素的微生物,（2）土壤中采样的注意事项,1） 由于土壤表层缺少水分，而且它以常受日光照射、风吹和行人踩踏，不利于微生物的生长，所以采样一般采集离地表515cm的土壤为样品。,2） 由于土壤水分过多，则可能造成土壤缺氧而使微生物生长不良，同时不仅能使土壤缺氧，而且由于流水，往往改变土壤中微生物的分布，因此避免雨季采样。,3）通风情况：在通风较好的土壤中，细菌、放线菌繁

4、殖较快，而通风差的土壤中，酵母、霉菌较多。,4）细菌或放线菌在碱性土壤中较多，它们在偏酸性土壤中受到抑制，而酵母菌则喜欢偏酸性的环境。,2 富集培养,根据所选菌种的生理特性，加入某些特定物质，使所需的微生物繁殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物生长繁殖。,如： 筛选纤维素酶生产菌：以纤维素作为唯一碳源 筛选脂肪酶：以植物油作为唯一碳源 筛选酵母菌：控制适宜的培养基和pH值，可降低细菌的增殖率，霉菌生长慢 筛选放线菌：在土壤样品的悬浮液中加10%的酚数滴 筛选霉菌：一般在培养基临用前添加灭过菌的乳酸或链霉素,富集培养的方法,1）控制营养成分 营养成分是C、N、无机盐及维生素等，各种微生物对各

5、种营养成分的要求是有差异的，因此，控制富集培养基中的营养成分，对浓缩所需菌种是有益的。,2）控制培养基的酸碱度 各种微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的，细菌和放线菌一般要求中性和偏碱性，酵母和霉菌一般要求偏酸性。故可将培养基调节到一定的pH值有利于抑制不需要微生物的繁殖。,3）控制培养温度和热处理 不同种类微生物所适宜的生长温度不同，利用不同培养温度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。,4）添加抑制剂 添加专一性抑制也可达到抑制不需增殖的微生物的目的。,3 纯种分离,常用的分离方法有划线法和稀释法。,划线法将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌

6、落。,稀释法不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其它微生物而单独生长为菌落，从而得到纯种。,可通过控制营养成分、培养基pH、添加抑制剂、培养温度、通气条件及热处理来提高筛选效率。,4 生产性能的测定,生产性能的测定可分为初筛和复筛。,筛选时培养条件确定是关键，培养基的组成、通风量、pH值、培养温度应根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件以及前人经验等到进行综合考察，慎重选定。,一般来说，初筛时，一株一瓶，根据测定结果取其中1020%进行复筛，复筛一般一株三瓶，进一步淘汰后可作几种培养条件的尝试，直至留下多次考察生产性状好的35株菌株。,工业菌

7、种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,二 微生物的育种,工业菌种育种的方法,诱变 基因转移 基因重组,1 诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱发突变是指用各种物理和化学等因素人为的使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化,物理诱变剂 物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子等。 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验

8、室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,紫外作用光谱正好与细胞内核酸的吸收光谱一致，因此，在紫外线光的作用下能使DNA链断裂、DNA分子内和分子间发生交联，从而导致菌体的遗传性状发生改变。,紫外线诱变枯草芽孢杆菌,化学诱变剂 化学诱变剂：如甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、5-氟尿嘧啶、秋水仙碱、亚硝酸、氮芥等。 它们作用于微生物细胞后，能够特异的与某些集团起作用，即引起物质的原发损伤和细胞代谢方式的改变，失去亲株原有的特性，并建立起新的表现。,甲基磺酸乙酯,亚硝基胍,5-氟尿嘧啶,秋水仙

9、碱,表2.1 各种化学诱变常用的浓度、处理时间等参考资料,表2.2 菌种选育常用诱变剂,基因转移是用物理的、化学的或生物学的方法将目的基因导入受体细胞并使之表达的一种技术。 包括横向和纵向两个方向：纵向传递即通过繁殖进行的亲代和子代的基因传递；横向传递：是指在差异生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流。,2 基因转移,3 基因重组,发生在生物体内(如减数分裂中异源双链的核酸交换)和在体外环境中用人工手段使不同来源DNA重新组合的过程。,出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选,2 诱变育种的步骤,(一)出发菌株的选择,（1）自然界新分离的野生型菌株

10、，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 （2）在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 （3）每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 （4）出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 （5）要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 （6）根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,(二)处理菌悬液的制备,

11、这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,(三)诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主

12、。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,第四节 工业微生物菌种的保藏,微生物菌种保藏的基本原理 根据微生物生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。,特点：低温、干燥、缺氧。,一 斜面保藏法和穿刺保藏法,1 斜面保藏法,方法：当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后

13、，一般在5左右可保藏36个月，到期后重新移种一次。 特点：适用范围广（细菌、真菌和放线菌），但传代多了容易发生变异，同时污染机会也增加。,2 穿刺保藏法,方法：将培养基制成软琼脂，装入小试管内，灭菌后用接种针将菌种穿刺接入培养基中，生长旺盛时覆盖23 mm的无菌液体石蜡。菌种可在冰箱中保藏半年至一年。 特点：有些真菌可保藏10年，适于形成孢子能力很差的丝状真菌，对固氮菌、双歧杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等不适宜。,二 干燥保藏法（沙土管法）,方法：在小试管内盛入土壤或砂子，121灭菌23次，细菌加入浓的悬液，真菌和放线菌可直接刮下孢子匀和（载体湿润），将小试管放入真空干空器或在干燥器中加入五氧化

14、二磷，试管口可熔封或用石蜡封口，置于5保藏，其保藏期一般为两年，有些可达10年。 特点：此法适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌，存活期短。,三 悬液保藏法,方法：在将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水、磷酸缓冲液或生理盐水中保藏，大部分能保藏一年或更长。 特点：此法适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。,四 冷冻干燥保藏法-比较常用,1 保藏原理,在将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。,2 保藏方法,（一）安瓿管的准备 将安瓿管洗净后干燥，灭菌后，再在60烘箱中干燥。 （二）分散剂的准备 其作用是尽量减少

15、冷冻干燥时对微生物引起的损伤。常用的分散剂有脱脂牛乳和血清。,（三）收集菌种 培养时间要掌握在生长后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵抗力较弱，产孢子的微生物需适当延长培养期以得到成熟的孢子。 在无菌条件下用毛细滴管加入到灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管装量约为34滴。 （四）冷冻 装入悬液的安瓿管应立即冷冻，冷冻温度达-30即可。 （五）真空干燥 冷冻结束后应立即进行真空干燥。,（六）安瓿管的熔封 熔封是在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。 （七）标签 在安瓿管灭菌前加入有菌名、日期的小纸片。 （八）安瓿管的保藏 冷安瓿管应置于45下低温保藏，保藏期一般可达510年。 （九）安瓿管的启封

16、 在无菌条件下，将熔封口处在火焰上稍加热，立即加上12滴无菌蒸馏水，使玻璃产生裂缝，轻击即可断落。一般使用经过复壮的第二代菌种。,五 液氮保藏法,方法：在将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，加入浓度为10%的甘油或5%的DMSO作为防冻的保护剂，熔封后开始降温至-25。将安瓿管保藏至-196的液氮中。此法一般可保藏23年，有时可达9年。 特点：效果好、方法简单、保藏对象广泛，但不能发送菌种。,六 低温保藏法,方法：在密封性能好的螺旋口小管中加入12mL的菌液，真接放入低温冰箱中保藏。一般低温时效果好。 特点：保藏期一般为一年左右，有些菌可达10年，但要注意防止断电。,第五节 工业微生物菌种的扩大培

17、养,一 微生物的培养方法,1 表面培养,表面培养：将微生物接种在固体或液体培养基表面，在恒温条件下进行静置培养的方法。如固体斜面培养、固体平板培养、液体表面生长。 特点：表面的微生物既能与空气接触，又能与培养基接触吸收营养，多用于实验室。,2 固体培养,固体培养：将微生物接种在固体培养基上。 特点：设备简单、投资少，适合于小规模生产，但占地面积大，劳动强度大，产品质量不太稳定。,3 液体深层培养-多用于工业生产,液体深层培养：把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长的一种培养方法。深层液体培养一般需要通入空气并进行搅拌。 特点：可根据微生物需要合理调节生长条件，把微生

18、物的生长、代谢控制在最佳状态而收到较好的培养效果。,二 菌种的扩大培养,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,1 概述,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,2 种子的制备过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地

19、将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,3 斜面菌种的培养,4 一级种子的培养-摇瓶生产,通常在无菌室内进行。 生产中使用的斜面菌种不宜多次移种，一般只移接三次，避免由于菌种的自然变异引起菌种的不纯。,一级种子的培养通常用三角瓶进行液体恒温振荡，也称摇瓶。 三角瓶中的菌种由斜面培养的种子接入。 在某些发酵产品中，一级种子不用三角瓶，而是培养大型斜面（茄子瓶斜面）作为一级种子使用。,5 二级种子的培养-种子罐生产,一种子罐的大小根据发酵产品和发酵罐的容积配套确定。（如1%） 种子罐种子培养成熟后，需要检验种子的质量，如细胞形态、pH值。 在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培