第二章蛋白质化学.ppt

1、第二章 蛋白质化学(Protein Chemistry),蛋白质（protein）是生物活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者。 蛋白质是生物体的主要组成成份，是生命活动所依赖的物质基础，没有蛋白质就没有生命。,蛋白质化学概述,蛋白质生物学功能的多样性,1、生物催化功能 具有催化活性的蛋白质是酶,蛋白质化学,膜 蛋 白,2、生物体的结构成分,3、运输功能,血红蛋白在血中输送氧 肌红蛋白在肌肉中输送氧,膜蛋白起运输作用,4、运动作用： 动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动,5、免疫保护作用,抗体,6、激素作用： 胰岛素等7、接受和传递信息的

2、受体： 受体蛋白,8、控制细胞生长、分化： 生长因子、阻遏蛋白 9、毒蛋白： 植物、微生物、昆虫所分泌 10、许多蛋白在凝血作用、通透作用、 营养作用、记忆活动等方面起重要作用。,生长激素,胶原蛋白,原肌球蛋白,肌动蛋白,肌球蛋白,清蛋白原,血红素,红血球,一、蛋白质的组成,（一）蛋白质的元素组成： C、H、O、N 及少量的 S 特点：N 在各种蛋白质中的平均含量为16% 用定氮法可测定蛋白质含量： 蛋白质含量(g) = 蛋白质含氮量6.25,第一节氨基酸,(二）蛋白质的水解,1、完全水解：用浓酸、碱将蛋白质 完全水解为氨基酸。 酸水解：无消旋作用，产物为L-氨 基酸。 碱水解：多数氨基酸被破

3、坏，有消 旋现象。,2、部分水解： 一般用酶或稀酸在较温和条件下，将蛋白质分子切断，产物为分子大小不等的肽段和氨基酸。,蛋白酶： 胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。,二、氨基酸的化学,氨基酸（amino acid, 简写aa)： 蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。 天然蛋白质由20种氨基酸组成。最近有报道是由24种氨基酸组成。,氨基酸的化学,（一）氨基酸的结构,1、通式：,-氨基酸中碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸）,氨基酸的化学,由通式可得出：,1）组成蛋白质的aa都是-氨基酸 （除脯氨酸 亚 氨基酸外） ； 2）不同aa仅R链不同； 3）除甘氨酸外，其余aa的-碳原子 均为不对称碳原子。,

4、In protein chemistry, we use Greek letter nomenclature.,2、 -氨基酸的构型：,构型：由于基团或原子在空间排列的不 对称性而引起的光学活性立体结构 称立体构型。 立体构型： 氨基在左为L-型； 氨基在右为D-型,天然pr中的aa均为L-型； 两型aa的生理功能不同。,氨基酸的化学,Lined up by similarity: chiral to chiral, COO to CHO,3、 - 氨基酸具旋光性,左旋（-）：能使偏振光向左； 右旋（+）：能使偏振光向右。,氨基酸的化学,4、 构型与比旋光度无直接对应关系,氨基酸的旋光性和旋光

5、角度与R基团的性质及测定时溶液的pH有关； 当某氨基酸以等量L、D型混合时，旋光抵消，称外消旋； 化学合成所得氨基酸为D、L各半的混合物，称DL型，无旋光性，可用化学或生化方法将二型分开，此时才表现出旋光性。,氨基酸的化学,（二）氨基酸的种类及结构,1、按R基团的极性分： 极性氨基酸： 极性不带电荷：丝、苏、天冬酰胺、 谷氨酰胺、酪、半胱、甘 极性带负电荷：天冬、谷、 极性带正电荷：组、赖、精、,非极性氨基酸：丙、缬、亮、异亮、 苯丙、甲硫、脯、色、,氨基酸的化学,2、按结构可分为： （1）脂肪族侧链：,氨基酸的化学,甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸,丝氨酸,脯氨酸,苏氨酸,2）芳香族

6、侧链：,苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸,3）含硫侧链：,半胱氨酸,甲硫氨酸,4）含氮碱性侧链：,组氨酸 赖氨酸 精氨酸,5）酸性及酰胺侧链：,天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺,3、按人体是否可合成来分：,必需氨基酸：机体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸。 赖、色、苏、缬、甲硫、亮、异亮、苯丙 半必需氨基酸：人体可合成，但幼儿期合成速度不能满足需要。 组*、精*、 非必需氨基酸：机体可自身合成的氨基酸。,氨基酸的化学,4、不常见的蛋白质氨基酸,胱氨酸：2个半胱氨酸脱氢形成胱氨酸,羟脯氨酸（胶原蛋白） 羟赖氨酸 6-N-甲基赖氨酸,5、非蛋白质氨基酸：,L-瓜氨酸， L- 鸟氨酸：参加尿素循环；

7、 -丙氨酸：维生素前体； -氨基丁酸：神经递质； D-谷氨酸、 D-丙氨酸：细菌细胞壁的组分。,氨基酸的化学,（三）氨基酸的重要理化性质,1、一般物理性质： 2、两性解离与等电点（两性性质）： （1）氨基酸为两性电解质：,氨基酸的化学,（2）aa解离方式取决于所处环境的pH：,氨基酸的化学,在电场中，阳离子向负极移动；阴离子向阳极移动； 调整pH，使aa净电荷为零时，aa既不向阳极也不向阴极移动。,（3）等电点（isoelectric point, 缩写为pI）,规定aa净电荷为零时的pH为该aa的等电点,氨基酸的化学,（4）pI的测定：,基于aa所带基团均可解离； 酸碱滴定法； 得到弱酸弱碱

8、曲线； 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点： pK：解离常数。 以甘氨酸为例：,氨基酸的化学,由此可知：,在生理pH内，aa 的羧基和氨基全部解离； 具有这种性质的物质称两性电解质； 带有相反基团的分子叫两性离子； 滴定中Gly的阳离子（R+）、阴离子（R-）和两性离子（R）的比例随pH而变； 当溶液中只有两性离子时， pH = pI,（5）等电点的计算,由式可知解离常数：,氨基酸的化学,由此可知： 已知在pI时， R+= R-， 整理可得：,K1 K2 =,H+ 2,两边取负对数： -lg H+ 2 = - lg K1 + - lg K2 -lg H+ = pH - lg K1 = pK

9、1 - lg K2 = pK2 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH，则 pI = （ pK1 +pK2） Gly：pI = （2 .4 + 9.6) = 5.97,由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧 基团pK值之和的一半。,A、对侧链R基不解离的中性氨基酸： pI=1/2（ pK1+ pK2） 即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。,B、对有三个可解离基团的氨基酸：,如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算： a、先写出其解离公式； b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。 技巧：求两个最接近的PK数值的平均值,如：天冬氨酸,如赖

10、氨酸：,总结,氨基酸的等电点的性质： a、各种aa的pI不同，PI是aa 的特征常数； b、同一pH下，各种aa所带电荷不同； pHpI ：aa+ pHpI：aa- 用离子交换、电泳将aa分开 c、处于pI时，aa溶解度最小，易沉淀； 可分离aa。,3、紫外吸收性质：,只有芳香族氨基酸有紫外吸收能力，因其含有苯环共轭双键的R侧链。 酪氨酸 max：270nm 苯丙氨酸max ：259nm 色氨酸 max ：279nm 所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。此法快速简便。,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102

11、; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,4、氨基酸的重要化学性质,（1）与茚三酮的反应： -氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨和还原型茚三酮）生成兰紫色化合物（Pro和Hyp呈黄色），色深与溶液中氨基浓度成正比。,氨基酸的化学,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,反应要点 A.该反应由NH2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反

12、应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 D. 测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）,应用：可定性或定量测定各种氨基酸。,A.氨基酸定量分析（先用层析法分离） 根据颜色深浅，在570（440）nm处 测OD值，可知样品中氨基酸含量。 B.氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸 分离，自动定性定量，记录结果。 C.定量释放的CO2可用测压法测量，计算出 参加反应的aa量。 D. 蛋白质和多肽亦可反应，但灵敏度差。,氨基酸的化学,桑格尔反应（SANGER REACTION）,A.为- NH2的反应B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(

13、卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,反应特点,Edman反应,由Edman于1950年首先提出为- NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法 Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定,其他化学反应,与二硝基氟苯（D

14、NFB）的反应 DNP-aa 异硫氰酸苯酯(PITC)的反应 PTH-aa 与丹磺酰氯(DNS-Cl)的反应 DNS-aa 与甲醛反应 与荧光胺的反应 与5，5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)的反应,氨基酸的化学,DNS-Cl反应,用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定氨基酸 原理DNFB法相同，是氨基酸的- NH2参加的反应 DNS-氨基酸在紫外灯下发黄绿色荧光 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量，样品最低用量可在5pmol,与甲醛的反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,5、氨基酸的