生物化学课件：第五章 核酸

1、第五章 核酸 Nucleic Acid,主要内容,核酸与生命遗传 核酸的分类和组成 核酸的结构 核酸的性质 核酸碱基顺序的测定 核酸的生物功能 核酸的体外生物合成法 核酸化学中的几种重要新技术,5.6 核酸的生物功能,一、DNA的复制-生物遗传信息的保持 DNA复制的要点是： 1、在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。,2、以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则, 在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。,半不连续复制,5.6 核酸的生物功能,3、通过DNA复制形成的新DNA分子, 与原来的DNA分子完全相同。 经过一个复制周期后，子代DNA

2、分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。,5.6 核酸的生物功能,DNA复制过程 98/pub/flash/24/menu.swf,5. 核酸的生物功能,二、RNA参与生物 遗传信息的表达 首先，DNA通过转录 作用，将其所携带的 遗传信息（基因） 传递给 mRNA, 在三种RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。,5.6核酸的生物功能,1、基因的转录 mRNA的合成 基因转录是以DNA为模板合成与其碱基顺序互补的mRNA的过程。 细胞生长周期的某个阶段，DNA双螺旋解开成为转录模板，在RN

3、A聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我复制，即其本身不能作为复制模板，因此在转录过程中即使出现某些差错，也不会遗传下去。,5.6核酸的生物功能,转录过程,5.6核酸的生物功能,mRNA是DNA的转录本，携带有合成蛋白质的全部信息。蛋白质的生物合成实际上是以mRNA作为模板进行的。,5.6 核酸的生物功能,遗传密码 mRNA分子中所存储的蛋白质合成信息，是由组成它的四种碱基（A、G、C和U）以特定顺序排列成三个一组的三联体代表的，即每三个碱基代表一个氨基酸信息。 这种代表遗传信息的三联体称为密码子，或三联体密码子。,5.6 核酸的生物功能,遗传密码 mRNA分子的碱基顺序即表示了所合成蛋

4、白质的氨基酸顺序。 mRNA的每一个密码子代表一个氨基酸。20种基本氨基酸的三联体密码子都已经确定。此外，还有一个密码子是肽链合成起始密码子, 三个是终止密码子，以保证蛋白质合成能够有序地进行。,5.6 核酸的生物功能,遗传密码,5.6核酸的生物功能,翻译过程,2、tRNA的功能 氨基酸臂：位于链的3-OH段部分。 是tRNA识别、结合和活化氨基酸的 部位。 反密码臂：位于下端的凸环部分。含有特殊顺序的三联体。反密码子与mRNA上的三联密码子互补对应 3、rRNA 构成核糖体的主要组成部分。核糖体是蛋白质生物合成的基地。,5.6 核酸的生物功能,三、蛋白质的生物合成（1）氨基酸的活化 tRNA

5、在氨基酰-tRNA 合成酶的帮助下，能够识别相应的氨基酸，并通过tRNA氨基酸臂的 3-OH 与氨基酸的羧基形成活化酯氨基酰-tRNA。 氨基酰-tRNA的形成是一个两步反应过程：第一步是氨基酸与 ATP 作用, 形成氨基酰腺嘌呤核苷酸； 第二步是氨基酰基转移到 tRNA 的 3-OH 端上, 形成氨基酰-tRNA。,5.6 核酸的生物功能,氨基酸的活化,5.6 核酸的生物功能,氨基酸活化的总反应式是： 氨基酰-tRNA 合成酶 氨基酸 + ATP + tRNA + H2O 氨基酰-tRNA + AMP + PPi 每一种氨基酸至少有一种对应的氨基酰-tRNA 合成酶。它既催化氨基酸与 ATP

6、 的作用, 也催化氨基酰基转移到 tRNA。 氨基酰-tRNA 合成酶具有高度的专一性。 每一种氨基酰-tRNA 合成酶只能识别一种相应的tRNA。 tRNA分子能接受相应的氨基酸, 决定于它特有的碱基顺序, 而这种碱基顺序能够被氨基酰-tRNA 合成酶所识别。,5.6 核酸的生物功能,(2)氨基酰-tRNA在mRNA模板指导下组装成蛋白质 氨基酰-tRNA通过反密码臂上的三联体反密码子识别mRNA上相应的遗传密码，并将所携带的氨基酸按mRNA遗传密码的顺序安置在特定的位置，最后在核糖体中合成肽链。,5.6 核酸的生物功能,5.6 核酸的生物功能,现在已经知道作为多肽合成起始信号的密码子有两个

7、，即甲硫氨酸的密码子(AUG)和缬氨酸的密码子(GUG)(极少出现)。在大肠杆菌中, 起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸。,5.6 核酸的生物功能,从DNA到 蛋白质,5.6 核酸的生物功能,中心法则 生物的遗传信息从 DNA传递给mRNA的过程称为转录。 根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。 1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。,5.6 核酸的生物功能,四、遗传变异的化学本质 DNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异。 所以，一切生物的变异和进化都可以认

8、为是由于DNA结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。,5.6 核酸的生物功能,1.DNA结构变化的类型 生物遗传变异的分子机制是DNA分子中为氨基酸编码的 三联体密码子的改变。 DNA遗传密码的改变 主要有如下几种类型： 碱基顺序颠倒 如TA被颠倒成AT；,5.6 核酸的生物功能,2) 某个碱基被调换 如AT换成GC；,5.6 核酸的生物功能,基因突变 上述DNA碱基顺序的改变，是DNA在复制过程中出现错误产生的。由于DNA是具有复制功能的分子，一旦DNA碱基顺序出错，它就会通过复制机制遗传下去。 由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，称为基因“突变”。,5.6 核酸的

9、生物功能,2、影响因素 DNA分子中碱基互变异构 DNA分子的碱基，存在酮式烯醇式或氨式 亚氨基式互变异构。不同的互变异构体形成 氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时 出现错误。 例如在正常情况下，A（氨基式结构）与T （酮式结构）配对；当A以亚氨基式存在时 （几率非常小），则与C配对。,5.6 核酸的生物功能,物理因素 能够引起基因突变 的物理因素主要包 括：紫外线（UV）、 高能射线和电离辐射 等。当DNA受到大剂 量紫外线（波长260nm 附近）照射时，可引 起DNA链上相邻的两个 嘧啶碱基共价聚合， 形成二聚体，例如TT 二聚体。,5.6 核酸的生物功能,光聚合反应 胸腺嘧啶碱基在紫

10、外光照射下，可以发生二聚加成反应： 在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。,5.6 核酸的生物功能,X-射线以及放射性物质产生的辐射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化学性质的改变。另外，电离辐射将也能使DNA周围环绕的其它分子（主要是水）产生具有很高活性的自由基，这些自由基能够进一步与DNA分子反应，导致DNA结构发生变化。,5.6 核酸的生物功能,(3) 化学因素 化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。 烷基化试剂能够与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化D

11、NA。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，DNA链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致DNA链的断裂。,5.6 核酸的生物功能,烷基化反应 由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。 鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。 这种情况将引起DNA的复制、转录及信息表达出现错误。,5.6 核酸的生物功能,环外氨基的反应 环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。 胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。 腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，

12、分别形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）。 这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。,5.6 核酸的生物功能,5.6 核酸的生物功能,碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。 常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对。 又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD），是一种具有强烈致癌和致畸物质

13、。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。,5.6 核酸的生物功能,五、核酸的催化性质 1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体 RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自 身催化切除内含子，完成加工过程。 该具有催化活性的RNA的发现改变了传 统上“酶是蛋白质” 的观念，从此对具有 催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)的 结构、催化机制以及应用的研究日益深入。,5.6 核酸的生物功能,1984年Science发表的题为“First True RNA Catalyst Found”的报道标志着RNA催 化剂的正式诞生。 Thomas Cech等把这类具有催化

14、裂解活性的RNA分子取名为Ribozyme，在我国1994年科学出版社出版的英汉分子生物学与生物工程词汇将Ribozyme译为核酶。,5.6 核酸的生物功能,目前为止，在自然界中发现的核酶根据其 催化的反应可以分成两大类：,剪切型核酶,剪接型核酶,核酶,核酶,剪切型 核酶,剪接型 核酶,异体催化剪切型或 分子间催化剪切型 核酸酶,自身催化剪切型或 分子内催化剪切型 核酸酶,核酶的分类,似乎最有应用前景，因为人们对它的剪切机制和分子结构要求已经有所了解，可以针对病毒核酸、不良基因或恶性基因进行人工设计、合成相应的各种RNA或DNA片段作为核酸酶基因，定向地剪切病毒核酸或不良基因以及它们的转录中间

15、产物，抑制它们的表达，进行疾病治疗,5.6 核酸的生物功能,1、剪切型核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。主要包括锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP,核酶的结构,核酶 的结构,锤头状模型,发夹模型,自身剪切的核酶的二级结构,5.6 核酸的生物功能,2、剪接型核酶实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切 酶和连接酶两种活性。主要包括组I内含子和组II内含子 这类核酶比较复杂，通常包括200个以上核苷 酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。像蛋白质 酶一样，内含子形成高级结构的折叠结果使关 键残基形成活性部位，在辅助因子的参与

16、下实 现自身剪接。,5.6 核酸的生物功能,核酶(脱氧核酶)的应用 基因治疗的概念出现在二十几年前，现在 已经在临床上得到了实际应用。基因治疗 最早的临床研究是1990年Blaese 等进行的 对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗，随后 在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病的治 疗中得到广泛的应用。 中国也是开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理想的效果。,5.6 核酸的生物功能,基因治疗的主要策略可以分为: (1) 向体内导入外源基因取代体内 的有缺陷的基因发挥作用； (2) 对致病基因进行抑制。 用反义核酸或核酶通过干涉致病基因的转录或翻译而清

17、除其表达产物。,5.6 核酸的生物功能,对医疗应用来说最主要的还是那些具有切割特定 RNA顺序，从而可以在体内抑制某些有害基因的核 酶。利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理,5.6 核酸的生物功能,在治疗人类疾病方面，核酶(脱氧核酶)在 防治动、植物病毒侵害以及基因组研究等 分子生物学实验中也有一定的应用。 例如田波等设计了针对马铃薯PSTVd (potato spindle tuber viroid)病毒负链 RNA的核酶，用载体pROK2携带核酶基 因转移进入马铃薯中，转基因的马铃薯表 现了对PSTVd明显的抵抗能力,核酶 的缺陷,切割效率比较低,稳定性较低,难以引入体内,需进行深 入

18、的研究,核酶的应用前景 十分诱人,核酶,5.6 核酸的生物功能,核酶由于具有许多优点而受到重视，例如 用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫 原性，对具有切割活力的核酶可以更加自 由的设计其切割RNA的位点。 分子进化工程的诞生，使核酶的研究迅速 发展，人工进化出自然界中不存在的多种 功能的核酶（包括单链DNA酶），这些 研究成果在理论和实际应用中都有着巨大 的意义。,5.7 核酸的体外生物合成法,DNA的体外生物合成 DNA聚合酶的发现：从1950年起，科恩伯格等人开始寻找合成DNA和RNA的酶类。他们首先研究了核酸的基本成分，以及细胞如何制造这些组件，接着又研究这些基本单元如何在酶的帮助下一

19、步步的组装成DNA 和RNA。1955年，科恩伯格终于从大肠杆菌中分离出DNA聚合酶，它可以忠实的复制DNA。 DNA聚合酶的发现，为理解遗传机制以及现代DNA重组技术的发展作出了重要的贡献。科恩伯格及其同事奥乔亚共享1959年诺贝尔奖生理学及医学奖。,美国科学家, Kornberg 1955年从E.Cole 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制机理研究打下了基础。为此，Kornberg 1959年获得诺贝尔奖。,Arthur Kornberg,5.7 核酸的体外生物合成法,DNA体外生物合成必须具备下列条件： 存在有DNA聚合酶； 四种dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTT

20、P； 一条DNA单链作为DNA合成模板； 一个引物DNA；新的DNA链合成将从引物DNA的3-OH开始，聚合反应按53的方向进行。 存在一定浓度的二价金属离子Mg2+。,5.7 核酸的体外生物合成法,RNA体外生物合成必须具备下列条件： RNA聚合酶； DNA模板；双链DNA中的一条链作为RNA合成的模板 四种NTP: ATP, GTP, CTP, UTP ； 一定浓度的二价金属离子Mg2+和Mn2+ 。,5.7 核酸的体外生物合成法,RNA链中3,5-磷酸二酯键的形成,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,一、DNA重组技术和基因工程 技术建立的前提 不同的基因具有相同的物质基础 基因是可以切

21、割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因可以通过复制传给下一代,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,DNA重组技术和基因工程 1973年，美国斯坦福大学教授科恩，从大肠杆菌里取出了两种不同的质粒，它们各自具有一个抗药的基因。 科恩把两种质粒上不同的抗药基因“裁剪”下来，再把这两种基因“拼接”在同一个质粒中。 当这种杂合质粒进入大肠杆菌体后，这些大肠杆菌就能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具备双重抗药性，拉开了基因工程时代的大幕。 科恩本人也以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,

22、DNA重组技术和基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程已经广泛应用在医药保健、农牧业、生态环保等领域，促进了人类社会的进步和发展。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因工程研究的主要内容 1）带有目的基因的DNA片段的分离或人工合成； 2）在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到载 体上，形成重组DNA分子； 3）重组DNA分子导入受体细胞（也称宿主细胞或 寄

23、主细胞）； 4）带有重组DNA分子的细胞培养，获得大量的细 胞繁殖群体； 5）重组体的筛选； 6）重组体中目的基因的功能表达,基 因 工 程 最 基 本 的 过 程,基因工程的基本过程,抽取DNA,切下鼠DNA,切开质粒DNA,将质粒导入宿主细胞,混合、连接,重组DNA技术,基因工程的基本过程,培养基中加抗生素,培养,裂解细胞释放DNA,分子杂交,分离扩增目的克隆,重组DNA技术,基因工程的应用,基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。（1）在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,胰岛素 1000 磅牛胰 10 克胰岛素 20

24、0 升发酵液 10 克胰岛素,干扰素 1200 升人血 1 升发酵液 23 万美元 / 病人 200300 美元 / 病人,（2）用于提高奶酪产量 生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。,（3）转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播种。,转基因植物获得新的性状,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,(4) 工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并

25、获专利，用于清除石油污染。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,二、PCR技术 1983年美国Cetus公司的Mullis等人建立起了一套大量快速地扩增特异DNA片段的系统，即聚合酶链反应（PCR）系统。这一实用性的发明在短短8年后获得诺贝尔奖，显示了PCR技术的重大价值，在分子生物学领域带来了一场重大的变革。 PCR技术成为了体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段的基本技术。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,PCR（polymerase chain reaction）聚合酶链反应技术，又称“基因扩增技术”，是一种在体外利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内复制过程，在附加的一对

26、引物之间诱发聚合酶反应。 全过程分DNA模板变性、模板与引物结合及引物延伸三个步骤。 此项技术广泛应用于分子生物学的各个领域，包括基因诊断、分离、克隆、核酸序列分析、突变体和重组体的构件和基因表达调控研究等。,PCR 反应,聚合酶链反应（PCR）原理,PCR是应用最广的分子生物学技术，在DNA测序中只用了单链扩增技术，所产生的模板DNA并不指数上升，而只以热循环数为倍数。,DNA聚合酶链式反应PCR,DNA聚合酶链式反应PCR,DNA聚合酶链式反应PCR,模板DNA（单链） 引物 DNA聚合酶（Taq） dNTP Mg2+,POLYMERASE CHAIN REACTION：http:/www

27、./ddnalc/resources/pcr.html,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,三、基因药物 1、概念 基因：染色体上的DNA片段，是遗传信息 结构和功能的基本单位。 基因 决定 生老病死 控制 高矮胖瘦 影响 喜怒哀乐 基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因与疾病 基因与人类的疾病密切相关： 遗传病是由于基因先天缺陷所致; 肿瘤的发生涉及多种基因改变, 包括癌基因激活或抑癌基因失活; 高血压, 糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变; 由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关, 存在易感人群和耐受人群.,5.9

28、核酸化学中的几种重要新技术,基因药物： 将具有治疗作用的基因重组进真核表达载体，直接转移到人体细胞，表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽，从而达到治疗作用的新方法。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因治疗和传统的基因工程的区别 二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因”。 基因工程： 目的基因载体导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋白经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品, 最终制造出一种蛋白类的药物。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因治疗：目的基因载体导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白达到治病的目的。 基因治疗在技术上一旦成功, 其优

29、势： 制品为基因及其载体，非基因表达蛋白 产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺 生产成本远远低于基因工程产品 从理论上讲,凡能治病的基因，都有可能开发 成为“药物” 半衰期,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。 例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。 因此，基因治疗是生物高技术的高度集成， 是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子 病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。,全球第一个基因治疗类药物在中国诞生,

30、2003 年10 月16 日深圳赛百诺技术有限公 司研制开发的抗癌新药“重组人P53 腺病 毒注射液”(商品名Gendicine“今又生”) 获得 国家食品药品监督管理局(SDA) 颁发的新药 证书。这标志着，世界上第一个基因治疗产 品在深圳诞生，也意味着我国在基因治疗药 物研制和产业化方面已达世界领先水平。这 种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因 治疗制品，计划于2004 年1 月正式上市。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,60% 的癌症病人的p53 基因存在着变异，由于这种腺病毒注射液含有正确p53 基因，注射到人体内，正确的基因会纠正已经变异的基因，从而达到治疗疾病的目的。 Gen

31、dicine 对头颈部癌症的治疗效果最明显，比如 鼻咽癌。其次对肺癌、膀胱癌等八种癌症也有很好的治疗效果。临床结果，其中肿瘤消失的有60%，肿瘤缩小率达到90%。,四、反义核酸技术 应用碱基配对的原理，以体内表达某种特定蛋白质的靶基因为基础，人工设计一段与之互补的基因片段封闭该靶基因，直接阻断该蛋白质的产生。针对有害基因，突变基因，非正常基因及其过度表达的基因，科学家设计了反义核酸，使这些基因关闭或者低表达。 反义核酸是人工合成的DNA片段（简称寡核苷酸），它与待封闭基因的某一区段互补，能够抑制或封闭靶细胞基因的表达。由于它与基因序列（称为正义链）碱基互补，或者说具有某种意义上的“镜象”关系，

32、因此，这类寡核苷酸称为“反义核酸”。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,自1978年反义核酸概念提出，到1998年10月第一个反义核酸药物在美国问世，标志着反义核酸理论已趋于成熟。人类基因组计划的进展为反义核酸技术的发展奠定了坚实基础。 近年来，国际著名的大型制药公司纷纷以各种方式介入反义技术研究，并且有多个反义核酸药物进入三期临床试验，这些都表明反义核酸技术及其产品的发展前景十分广阔。 反义核酸技术在药物研究方面的发展日臻成熟，随着基因组学的发展，在其他方面的应用也开始受到关注。包括农业育种、功能基因研究、化妆品等方面都已经有了成功应用的例子。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,反义技术

33、是继基因克隆和重组技术之后在分子生物学领域中兴起的一门全新的基因工程技术。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康，已经成为高科技化妆品研究的一个热点。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,与疾病的产生原因相同，人体美的外在表现同样离不开基因。 基因通过其表达产物蛋白质调节人体各种生理和生化过程，从而产生影响人体美的结果。 应用反义核酸技术筛选出表达影响人体美的蛋白质基因，设计一段与之互补的反义片段，将其封闭，从源头上抑制这种蛋白质的产生，借此达到美容效果。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,反义核酸化妆品是在生物技术药物研究的

34、基础上最新发展起来的，与传统化妆品相比，具有高效、高选择性、安全环保的特点。反义核酸技术在化妆品领域异军突起，代表了化妆品发展的一个重要方向。 目前，国外已有多个化妆品产品应用了反义核酸技术，包括Christian Dior、日本SK-II、朗斯国际等，国内进行反义技术化妆品开发的企业还很少。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,反义核酸的生产是利用化学的方法人工合成的。在固相的配基上按照所需的序列逐一加上相应碱基。由于使用化学合成的方法，成本较高。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,基因治疗剂是生物技术药物第三大类发展品 种，进入/期临床的基因治疗剂有25种, 其中15种用于治疗肿瘤。 已

35、研究开发和进入临床试验的反义药物有38种，主要由ISIS公司所开发，也是以治疗肿瘤为主。其中Isis2922是FDA批准的第一个反义药物，用于治疗艾滋病的巨噬细胞病毒性视网膜炎。,DNA序列的改变称为突变, 这将导致相关蛋白质的序列变化. DNA上特定核苷的取代技术称作基因定位突变法(site directed mutagenesis). 1978年发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。寡核苷酸的定向（定点）诱变是人工合成的寡聚核苷酸进行的离体定向诱变，可完成插入、缺失、碱基置换等各种类型突变。 寡核苷酸的定向诱变，主要是利用带有预定突变序列的寡核苷酸单链做引物，在体外与外源基因序列退火，指导合成少量

36、完整的突变基因，然后通过体内扩增得到大量的突变基因。 利用该技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。,五、基因定位突变和DNA改组技术,基因定位突变,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,1994年，一种崭新的定向分子进化新技术DNA改组(DNA shuffling) 在美国Affymax研究所的Stemmer实验室悄然出现。 该技术在试管里模拟达尔文进化的过程，在分子水平上创造分子的多样性（molecular diversity），结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的变异。 几年来，它以强大的生命力，在世界各

37、地许多实验室里“生根发芽，开花结果”。DNA改组技术的日臻成熟及推广应用，推动了生物工程的诸多领域突飞猛进地向前发展。作为生物工程的新生长点，DNA改组必将带来一场深刻的技术革命。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,DNA改组技术,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,DNA改组是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。通过改变单个基因(或基因家族， gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 该技术是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)。在创造新基因的过程中，要设法产生

38、各种变异。这主要通过有性PCR(sexual PCR) 、交错延伸程序(stagger extension process， StEP) 完成。 值得指出的是，DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的选择或筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,较以往定向进化方法，DNA改组技术具有以下创新之处。 首先，DNA改组技术使得进化速度较常规的定向进化大大加快。在自然界中，一种蛋白分子的进化是一个极其漫长的过程，在突变与达尔文选择的动态平衡中缓慢进行，需要经过成千上万年的岁月。DNA改组技术创造

39、性地将这一历史过程缩短到有限的几天。这岂不是生物进化领域的技术革命!美国新科学家杂志形象地将DNA改组技术描绘为“有性的革命(sexual revolution)”。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,由于DNA改组技术能在分子的水平上大量创造和生产优质的分子，因此也称之为分子育种 (molecular breeding) 。 在优化包括质粒、部分基因组、病毒基因组在内的DNA序列方面表现出简便高效的特点。在某些方面， DNA改组技术像传统的定向进化方法，在进化过程中不必了解具体造成这种改变的中间过程的细节，只需要检测 DNA改组带来的效果。同时，与常规的定向进化程序相比，DNA改组技术有了质的飞跃。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,其次， DNA改组比随机诱变显著地提高了良性突变的概率。 美国得克萨斯大学奥斯汀分校的 ellington对随机诱变和DNA改组两种方法进行比较。结果表明，DNA改组技术比随机诱变具有较大的优势，随机诱变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组技术产生13%的良性突变；后者比前者的成功率高12倍。 Stemmer用DNA改组技术将细菌对抗生素的抗性提高了32 000倍，对照的随机诱变方法只能提高16倍。,5.9 核酸化学中的几种重要新技术,第三，DNA改组技术的方法巧妙，重点突出，着