第四章 抗体制药专题.ppt

1、第四章 抗体制药专题,第一节 抗体结构与治疗作用 抗体结构,抗原 一类能刺激人或动物产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内和体外特异性反应的物质。 抗体 抗原刺激人体或动物体的B细胞，由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白。 抗体功能区： VH+VL特异的抗原结合部位。 CL+CH1有L链与H链间S-S结合部位。 CH2补体结合位置 CH3固定组织细胞（单核、巨噬细胞等）,Fab木瓜蛋白酶水解IgG得到的两个相同的片段，含有完整的轻链和重链的上端。与抗原结合，二价抗体 Fc木瓜蛋白酶水解IgG得到的重链下端。与补体结合,抗体的治疗作用,1）抗肿瘤作用 2）抗感染作用 3）抗器官移植作用

2、 4）抗血栓形成 5）解毒 6）构建独特型疫苗 7）免疫性疾病及其变态反应性疾病治疗,分类,多克隆抗体 多种抗原决定族，多种抗体产生。 单克隆抗体 单一抗原决定族产生的均一性抗体 缺点：免疫原性，半衰期短，耙吸收差， 生产复杂，价格贵 基因工程抗体 抗体结构功能与基因重组技术结合,第二节 单克隆抗体,1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合 后发现： 通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此单克隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb）,简单生产过程,单克隆抗体的不足,.鼠

3、源单抗能够特异识别抗原,但是在人体中不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统. .鼠源单抗用于人体时常被人免疫系统识别,产生人抗鼠抗体(HAMA). 外源抗体在人体循环系统中很快被清除.,第三节 人源化单克隆抗体,鼠单抗的人源化，是为了克服鼠源MAb的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA反应。,人源化单克隆抗体技术前景,目前进入临床阶段的人源化单克隆抗体药物约有100个,估计占研制中的生物技术药物的25%.美国FDA批准生产的单克隆抗体有13种. 1997年第一个用于治疗淋巴瘤的人鼠嵌合型单抗Rituxan上市,该产品19

4、98-2000的销售额分别是1.5亿美元,2.6亿美元,4.2亿美元.增长很快.,抗体的人源化主要应考虑到两个基本的原则：,一是应保持或提高抗体的亲和力和特异性； 二是应降低或基本消除抗体的免疫原性,目前报道的人源化方法主要有:,嵌合 表面重塑(resurfacing) 重构(reshapping) 抗体功能片断,嵌合抗体,第一代的抗体人源化是将鼠MAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的HAMA反应。,嵌合抗体的产品实例,1986年winter 领导的小组把嵌合体中小鼠的成分削减到5-1

5、0%.形成了人化的鼠类单克隆,接着温特对技术加以改进,把嵌合体技术转化为生物技术产业. 1994年Eli Lilly 公司的产品Reporo是第一个获准上市的嵌合抗体-可以通过攻击血小板上的一种受体蛋白质靶,减少心血管病人形成血栓的危险.,嵌合抗体,从杂交瘤细胞中获得抗体V区cDNA,克隆到重组了人抗体C区的载体中,转化入动物细胞表达出人鼠嵌合抗体.改造后的抗体保留了原单抗特异结合的抗原V区,去除了非人源序列(c区),表面重塑,通常认为,抗原上的抗原决定簇应具残基的运动性和溶剂的可及性,多集中在抗原表面 该法的原则是仅替换与人抗体差别明显的区域,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体

6、表面残基相似的氨基酸替换,重构抗体,重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关残基与人抗体重新拼接构建的.通过置换三个发夹环的鼠抗体超变区(又称互补决定区,CDR),使构成抗原结合部位的轻重链各3个CDR区是鼠源的,其余均为人源的,抗体功能片段,Fab 片段抗体 由完整的轻链和重链（VH+CH1)组成 FV抗体 由VHVL 组成 单链抗体 VH Linker VL 单域抗体 VH 或VL 最小识别单位抗体 单个CDR,第三节 抗体库与基因工程抗体技术,如何得到人抗体的目标基因？ 噬菌体抗体库技术 (surface display phage antbody) 核糖体展示技术 转基因/转染色体动物技术

7、,噬菌体抗体库技术:,用PCR扩增抗体全套V区基因,重组到噬菌体载体,并通过与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,使Fab或者ScFv表达在噬菌体表面,形成噬菌体抗体库.采用亲和层析将固相化抗原与抗体库孵育,通过数次吸附-洗脱-扩增筛选出特异性噬菌体抗体,感染大肠杆菌后增殖,表达,活化,从而获得大量特异性抗体.,构建方法:,提取B 淋巴细胞RNA,扩增V区基因,用两种内切酶分别对纯化的轻链PCR产物及表达载体进行双酶切后分离纯化,连接 电转化感受态细菌并扩大培养,提取质粒,即为轻链库; 分别对经纯化的重链PCR产物和轻链库进行双酶切,纯化回收后连接,电击转化感受态细菌,加入辅助病毒进行培养 离心取

8、上清,加入PEG沉淀噬菌体颗粒,即为噬菌体抗体库,抗体库筛选,.将固相化抗原与抗体库孵育,只有在其表面表达与抗原有高亲和力抗体的噬菌体才能结合在抗原上 将这些噬菌体洗脱下来,转化感受态大肠杆菌进行扩增. 将获得的噬菌体颗粒在重复上述过程3-5次,从而使得噬菌体抗体的特异性加强,数量增加. 将最后一次富集后的噬菌体感染细菌铺盘,挑去部分集落制备抗体,并用酶链免疫吸附分析鉴定,以筛选特异性噬菌体抗体.,.,Ribosome display technology,The Display CycleThe display process used by Discerna is remarkably r

9、obust and can be summarised in the following sequence of seven technically simple steps:1. Take genes encoding the protein.2. Amplify genes using standard methods.3. Produce proteins tagged with their encoding gene in vitro.4. Affinity purify proteins using an appropriate ligand or antigen.5. Amplif

10、y the genes encoding the purified proteins using standard methods.6. Clone genes and express in bacteria.7. Lyse bacteria and purify proteins for use.,DiscernArray DiscernArray technology is a combination of PCR and cell free synthesis which allows the high speed parallel synthesis of antobodies. Th

11、e final stages of the process can allow an array of antibodies to be produced. In principal the technology can be applied to any type of protein.,Features1. DiscernArray converts PCR DNA into an antobody array in 3 hours or less, with no cloning or additional protein purification. 2. DiscernArray re

12、place cloning, in vivo expression systems and purification procedures, avoiding inclusion bodies, aggregation or degradation associated with bacterial expression. 3. DiscernArray can be made in high throughput format by carrying out multiple transcription/translation reactions in parallel.,抗体库技术,在一定

13、程度上较好的模拟了体内抗体生成的三个重要环节 1.多样性的B 细胞群体 2,克隆选择 3 亲和力成熟,如何生产基因工程抗体？,基因工程抗体 特点：保留抗体的抗原结合能力、降低生产成本、易于大规模生产 基本原理：借助基因工程手段，将编码Ab的基因重组到真核或原核表达载体上并进行表达。 基本的研究过程如下：,转基因组鼠生产人类抗体？,第四节 抗体治疗,抗体治疗已经进入到收获时期,全世界致力于人源化单克隆抗体开发的企业已有250家. 从目前已经上市的或者正处于临床试验阶段的单抗临床效果来看,许多治疗用单抗是安全有效的.随着生产单抗的新方法不断出现,单抗生产工艺的日趋成熟,治疗用单抗的疗效将大大提高,

14、毒性将越来越小,更容易被人们.许多业内人士认为将来会出现一个以抗体为基础的治疗新领域,抗体免疫偶联物（Immunocojugates）,由单抗（monoclonal antibody)与弹头药物(warhead drug)组成 弹头药物: 植物毒素 微生物毒素 抗代谢类药物 蒽环类药物 烷基化类药物 抗有丝分裂药物 抗生素,直接偶联法 （交联剂） 间接偶联法 （大分子载体） 毒素及大分子多肽类与单抗偶联 保持药物的生物活性 保持单抗对肿瘤细胞的特异性,重组免疫毒素,通过基于抗体的融合蛋白技术生产免疫毒素,抗体靶向的酶前药治疗,ADEPT: antibody directed enzyme pr

15、odrug therapy 两步给药系统： 1)应用肿瘤相关抗体与酶的偶联物使酶在肿瘤部位聚集，并留出时间使其从血液和正常组织中清除； 2）给予前药，使其发挥作用。,第五节 抗体酶,简单介绍,问世：1986年，Lerner和Schultz分别在Science杂志上报道了获得抗体酶的文章。 抗体酶 （abzyme），又称催化抗体（catalytic enzyme），是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应的免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性的反应。 想法的由来：抗体vs酶 类似处：主要成分都是蛋白质， 酶与底物的结合 抗体与抗原的结合 本质区别： 酶与反应过

16、渡态（激发态分子）选择结合； 抗体与基态分子的抗原特异性结合。,高度专一性,3. 酶的种类与抗体的种类简直不可同日而语。 至今为止发现的酶只有几千种； 抗体的种类则可以是无穷的。 所以，如果能将酶的催化活性赋予抗体，这将大大扩大酶的王国，是n多无法进行的或是在温和条件下无法进行的化学反应可行，这个又何乐而不为呢？,制备,诱导法（利用免疫系统诱导产生抗体） 抗原性物质选择：反应过渡态极不稳定，因此不可能用它对动物进行免疫诱导产生抗体。不过可以合成出能稳定存在的分子，它在带电性能、几何形状等方面和过渡态分子结构极其类似，这种分子称为过渡态类似物（transition-state analog，TS

17、A）。 免疫诱导：利用TSA作为半抗原（Hapten）和载体蛋白结合后对动物进行免疫诱导。 细胞融合：单克隆技术 由于这样诱导产生的抗体能和TSA特异性结合，那它就极有可能催化要经过该过渡态的化学反应，因而具有催化活性。 基因工程法 主要内容：对于已经产生的单抗，分析其aa序列或基因的碱基序列，对抗体结合部位的基因进行定位突变，换上有催化作用的aa。,2. 抗体基因的组合文库：通过PCR技术建立的基因库存储在噬菌体里，通过细菌培养表达抗体的有效片断，将它们用于催化反应比使用老鼠杂交瘤细胞要更快更方便。 拷贝法 第一步免疫： 已知的酶 抗该酶的抗体1 第二步免疫： 抗体1 抗抗体1的抗体2 由于

18、抗原和由其诱导产生的抗体具有互补性，经过两次拷贝后，原来酶的活性部位的信息翻录到抗体2上，使抗体2具有催化特性。 化学修饰法 通过化学反应，在抗体结合位置或是附近引入具有催化功能的基团或是辅助基团。,催化抗体的筛选,生物学筛选法 竞争性抑制筛选法 1）抑制剂：短的过渡态类似物（STA），它包括了TSA的所有结构 特征，最大限度地省略了与底物或是产物相同的结构特征。 2）如果：单抗与STA的结合活性单抗与Hapten结合活性 则： 单抗与过渡态的结合 单抗与底物或是产物的结合 3）结论：与过渡态的强结合性说明单抗可能具有催化活性 此法快速有效，可筛选出高催化活性的抗体酶。 催化酶联免疫吸附筛选法

19、 此法将待催化的反应与ELISA结合起来，在酶标反应板上进行。,1）将反应的底物结合到酶标反应板上； 2）将待测培养液上清加入反应孔中进行反应； 3）反应后，洗去上清，加入抗反应产物的抗血清， 判断：如果孔内显色出现阳性反应，则存在催化抗体； 否则则不存在有催化活性的抗体酶。 催化ELISA简单、易操作、准确率高，关键在于能否制备出抗反应产物的抗体,纯化学筛选法 荧光标记筛选法 化学直接筛选法 纯化学的筛选只能筛选出与Hapten高结合性的抗体酶，但是这种结合却与抗体酶的高催化活性不存在直接的关系。,存在的问题,催化活性低:一般为普通酶的1/1000 原因： 1）不可能设计出与过渡态完全一样的

20、分子； 2）底物结合与催化之间关系的脱离； 3）产生抗体的生物过程的功能缺陷。 抗体酶存在率低； 3. 制备过程费时费事且价格昂贵；,可能的应用,在不到20年的时间里，抗体酶的研究已经成为当今前沿多学科研究的交汇点，它开辟了催化剂研究的新领域，将在医学、化学、免疫学和制药学等学科种发挥重要的作用。 在艾滋病治疗方面 Gp-41：gp-41是HIV-1病毒一个重要的衣壳蛋白，在HIV感染人体过程中起着非常重要的作用。其上有一段相对稳定的肽链序列：RGPDRPEGIEEEEGGERDRD。 抗体酶轻链“切割”这段特异性的肽链 有文献报道称，能制备一种抗体酶的轻链（不必在重链的参与下）可独自专一性地催化降解gp-41那段特异性稳定的氨基酸序列。 3. 可同样“切割”重组gp-41蛋白，但是却对不含那段稳定氨基酸序列的BSA和HAS不起作用。,在戒毒方面的应用 难题： 毒品一直困扰着人类，很多人在吸毒上瘾或很难戒掉， 1）直接拮抗可卡因上瘾的抗体至今还没有找到； 2）即使存在有效的抗体，由于抗体和抗原形成的复合物 后无法再生，所以必须高剂量使用