微生物的遗传变异和育种.ppt

1、第七章 微生物的遗传变异和育种,微生物是现代遗传学、分子生物学和其它许多重要的生物学基础研究中最热衷选用的模式生物。,研究微生物遗传学的意义,为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快？ 根据化石记录显示，单细胞生物于35亿年前首次出现在地球上，但是之后它们用了大约25亿年进化成多细胞生物，剩下的10亿年却发展成了植物、哺乳动物、昆虫、鸟类等各种各样的地球物种。,Rice大学科学家的研究结果可望解决这一问题，他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和病毒不断在不同物种之间传递DNA，如果没有这种作用，只依靠基因突变和两性选择作用是不会达到如此快速度的。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生

2、物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品 的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产 量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产 菌种，才能达到目的。优良菌种的选育是在微 生物遗传变异的基础上进行的。 遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对 立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转 化的。,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。

3、特点：具稳定性。 遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和; 是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。 特点: a.在群体中出现几率极低，（一般为10-610-10） b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水

4、平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,遗传与变异的概念,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,表型饰变,第一节

5、 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。 基因学说：1933年 Morgan发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因的活性成分是蛋白质。,遗传变异的物质基础是核酸，通过以下三个经典实验加以证明 。

6、 、肺炎球菌的转化试验 、噬菌体感染试验 、植物病毒的拆开与重建试验,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation）：,1928年F.Griffith， 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,Griffith转化试验示意图,混合培养,R型活菌,S型活菌,S型热死菌,R型活菌,S型活菌,健康,病死,（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡抽取心血分离活的S菌,热死S

7、菌不生长活 R 菌长出R菌热死S菌长出大量R菌和少量S菌,（2）细菌培养实验,平皿培养,+活R菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery等从热死S型pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分,并在离体条件下进行了转化试验:,Avery

8、的实验说明： 只有S型细菌的DNA才能将pneumoniae的R型转化为S型;且DNA纯度越高，转化效率也越高。 也说明S型菌株转移给R型菌株的决不是遗传性状的本身，而是以DNA为物质基础的遗传信息。,（二）噬菌体感染实验,1952 年Hershey和Chase利用示踪元素，对大肠杆菌 T2 噬菌体进行了这类实验。,将E.coli分别培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中. 让 T2 噬菌体侵染培养后的E.coli ，从而使 噬菌体打上 35S 和 32P 的标记。 这种噬菌体再侵染不含标记元素的E.coli ，并在完成吸附和侵入后， 强烈搅拌洗涤，以便使吸附

9、在菌体外表的 噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,实验结果：几乎全部 35S 都在上清液中，而几乎全部 32P 和细菌一起出现在沉淀物中。 实验说明：在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（三）植物病毒的重建实验,1956年，H. Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花

10、叶病毒（TMV）进行了植物病毒重建实验。 具体步骤： 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：,（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 结果说明，RNA也是

11、遗传的物质基础,MTV HRV,HRV MTV,结论,通过这三个具有历史意义的经典实验，得到一个确信无疑的共同结论： 只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）细胞水平 从细胞水平来看为细胞核；除此之外，在细胞质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称这部分DNA 为质粒。 （二）细胞核水平 真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内DNA 与组蛋白结合在一起构成染色体。,（三）染色体水平 染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构 染色体的数目在不同的生物中是不同的 染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的

12、,（四）核酸水平 核酸种类：DNA，RNA 核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状 DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开 始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为 研究微生物学的最有力的手段。,（五）基因水平,A gene is anucleotide sequence that code for a polypeptide, tRNA, or rRNA,（六）密码子水平,（七）核苷酸水平 核苷酸是最小突变单位和交换单位,(二）原核生物的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 大小：约为2-100106D

13、alton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10200个或更多。,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒

14、的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,几种代表性质粒：,F因子（f

15、ertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertil

16、ity plasmid also carries antibiotic resistant genes.,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其

17、上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor）,（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因 抗性决定因子：抗性基因,产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048

18、104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个copy。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,（3）产细菌素的质粒（Bacteriocin pro

19、duction plasmid）,一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名： 大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主 对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。 这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒

20、，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4. 降解性质粒,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。 。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物

21、优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒（mega质粒）,7. Ri质粒（root inducing plasmid）,Agrobacterium rhizogens(发根农杆菌)可侵染双子叶植物根部,并诱发出大量称为发状不定根,其侵染后会将Ri质粒中的T-DNA可整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体,第二节 微生物的基因突变,一、基因突变 Mutations a

22、re stable, heritable alterations in the gene sequences, and usually, but not always, produce phenotypic changes. These mutations may be either spontaneous or induced by chemical mutations or radiation.指细胞或病毒粒内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,狭义：点突变 广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,基因突变,染色体畸变细胞学上

23、可以看到染色体的变化 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体(mutant):发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型(wild type):从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,一、基因突变的类型 基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型： （1）形态突变型。 （2）条件致死突变型。 （3）营养缺陷突变型。 （4）抗性突变型。 （5）抗原突变型。 （6）产量突变型。,突变率：每一细胞或病毒粒每一世代中发生某一性状突变的几率。也可用每一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株的数目来表示。 二、基因突变的特点 （1）不对应性。 （2）自发性。 （3）

24、稀有性。 （4）独立性。 （5）诱变性。 （6）稳定性。 （7）可逆性。,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,三个经典实验 变量实验 涂布实验 影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,野生型 （原始性状）,特定环境,突变型 （适应环境的新性状）,驯化,定向诱变,筛选,？,？,？,突变的原因,？,变量实验（fluctuation analysis）,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replica plating ）,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble Prize i

25、n Medicine and Physiology in 1958,（五）基因突变及其机制,1、诱发突变：物理、化学核生物的因素，提高突 变率的人为的作法 （1）碱基的置换,碱基的置换引起的突变,Transition and transversion mutation,直接引起置换的诱变剂：亚硝酸、羟氨和各种烷化剂。,间接接引起置换的诱变剂：碱基类似物。,Methyl-Nitrosoguanidine Mutagenesis,5-BU,（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误,错误 + 错误 -+ 正常 - 正常 + 正常,（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,DNA的转座:由

26、可移位因子介导的遗传物质重排现象。 转座子（Tn) 是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。 包括：插入序列（IS）、转座子（Tn）、转座噬菌体 特点： 在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上。 转座因子两端各有一段一定长度的末端重复序列。 每个转座因子带有一个对转座有特异功能的转座酶基因。,2、自发突变：无人为因素下的低频率突变原因： （1）背景辐射 （2）有害产物积累 （3）碱基错配,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,2、切除修复,二、突变与育种 （一）自发突变与育

27、种： 选育 定向培育 （二）诱变育种 1、诱变育种的基本环节,2、诱变育种的原则 （1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线 激光 离子束 X射线 r射线 快中子,烷化剂 碱基类似物 吖啶化合物,Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用,“生物化学统一性”法则： 人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则： 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比 超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用 90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,美国加利福

28、尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验,证明Ames试验重要性的应用实例： “反应停”， 60-70年代十分流行的一种降低妇女妊娠反应的药物。但畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用 但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，,（2）选用优良的出发菌株 （3）处理单细胞或单孢子悬浮液 （4）使用最佳诱变剂量 剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率 （5）利用协同效应 （6）寻找和利用形态、

29、生理与产量间的相关指标 （7）设计高效率筛选方案 （8）根据具体情况创造新型筛选方案,3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法）,夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法,生长谱法,作业：设计实验筛选一株抗氨卞青霉素的组氨酸缺陷型大肠杆菌。 分析转录时发生的错误与突变的异同。,基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。 重组是分子水平上的概念，可

30、以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组 特点：片段性 单向性 方式多样性：结合 转化 转导,外源基因的四种命运,（一）转化,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力 进行自然转化，需要二方面必要的条件：,1、建立

31、了感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的 能力，或人为地将DNA导入细胞内 2、外源游离DNA分子（转化因子）,转化的两种类型,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,转化过程的特点： a）对核酸酶敏感； b）不需要活的DNA供体细胞； c）转化是否成功及转化效率的高低主要

32、取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多,人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组 手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,（二）细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全普遍转导 流产普遍转导,低频转

33、导 高频转导,局限转导与普遍转导的主要区别,溶源转变,1普遍性转导 由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为 10-510-8。 2局限性转导 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA 可能与噬菌体DNA 发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为 10-6。,普遍转导（generalized transduc

34、tion）,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换 而形成稳定的转导子,流产转导,完全普遍转导,转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。 因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，在选择培养基平板上形成微小菌落,流产普遍转导,局限转导,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体

35、,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因,缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。,低频转导,低频转导 裂解物,正常噬菌体,极少量的部分 缺陷噬菌体 （局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子 （极少量）,低感染复数,高频转导,低频转导 裂解物,正常噬菌体,极少量的 部分缺陷噬菌体 （局限转导噬菌体）,转导颗粒,三次感染，三次整合，一次切割，两次复制，两次裂解，两次转导,高感

36、染复数,双重溶源菌,缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制,高频转导 裂解物,部分缺陷噬菌体 （局限转导噬菌体）,正常噬菌体,等量,转导颗粒,局限转导子 （大量）,低感染 复数,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,溶源转变是一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新

37、性状的现象。,溶源转变的特点： 1、噬菌体不携带任何供体菌的基因； 2、噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3、噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿主获得 新性状，无通过基因重组而形成的稳定转导子； 4、宿主获得新性状具有不稳定性,（三）接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,接合机

38、制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。 F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株； b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称

39、为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,1） F+F-杂交,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用； b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。,d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。 所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。,Hfr菌株的F因子插入

40、到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）Hfr F-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。 所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。 F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。 HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在

41、F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,中断杂交（interrupted mating）技术,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以 分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为 单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,大肠杆菌基因组很大（全部转移 需要100分钟），其遗传图谱须用 多株F因子整合在不同位置的Hfr 菌才能完成,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同： 供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组

42、； b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。,“接合” “转导” 及“转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：,外源DNA的来源及进入途径有差异,（四）原生质体融合,二、真核微生物的基因重组 （一）有性杂交,细胞（ ） 细胞（）,有性接合 染色体重组 新遗传型,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,（二）准性杂交,细胞（ ） 细胞（）,准性接合 基因重组 新遗传型,菌丝联结 质配 核配 有丝分裂

43、交换 单倍体杂合子,在半知菌类中最为常见,半知菌的准性生殖,准性杂交育种,作业,试分析比较： 原核生物与真核生物在基因重组方面的异同。 结合、转导与转化 普遍转导与局限转导 转座子、溶源性噬菌体与质粒,在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括以下四方面： 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。 菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高,或使它更适应于工艺的要求,这是育种工作的任务。 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务

44、。,第四节 微生物的菌种选育,一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞（或单孢子）菌悬液的制备 单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子106 /ml 、细菌108 /ml 诱变剂的选择及其剂量的确定 以致死率为9099 为宜诱变处理 物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定 同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法 重复筛选 摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,二、微生物的诱变育种,二、微生物的诱变育种,（二）变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,1 筛选用培养基 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示； 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如