蛋白组学-生物质谱.ppt

1、蛋白质组学,浙江大学 生命科学学院 江 辉,第三章 生物质谱技术,考试时间：2014年11月28日（周五） 下午1：15-3：15 考试地点：东1A-218 闭卷考试，考生自带笔、计算器，不许带电脑、手机以及能够上网的终端。,基质辅助激光解吸电离技术MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization),MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization),MALDI,MALDI,MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子,待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶

2、体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。,MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到分子离子峰，无明显碎片峰。此电离方式特别适合于飞行时间质谱计。,MALDI是以激光脉冲照射在固定于平面电极上的蛋白质分子，经平行电场加速，在由质谱仪进行分析。以波长337nm的氮气激光脉冲（此波长不会被蛋白质中的芳香环状分子所吸收，避免蛋白质碎裂）击打固定于基质上的蛋白质分子，使得蛋白质从基质上游离並帶上微弱的正电荷。此时再经由高能平行电场加速提高核质比，进入质谱仪进行分析，此方式能分析帶电量低的分子，以及含有許多不同种类分子的

3、混合物。 通常MALDI都会配上TOF（time of flight）分析器。 MALDI使用的基质有很多种，主要的三种为 : -cyano-4-hydroxycinnamic acid （-氰基-4-羟基肉桂酸） 2,5-dihydroxybenzoic acid （2，5-二羟基苯甲酸） sinapinic acid（芥子酸） 其中-cyano-4-hydroxycinnamic acid是最常用的基质。,常用的基质,寡核苷酸,常用的 MALDI matrices at 337 nm(N2),MALDI,用激光轰击样品使其离子化。 样品先与能够吸收紫外波长的基质混合 （sinapinic

4、acid for proteins, 4-hydroxycinnaminic acid for peptides） 激光波长与基质的最大吸收波长相同，在这个波长下，基质将本身的一部分能量传递给样品。,MALDI Ionization,基质发色团吸收紫外激光，电离。 基质分裂，电荷转移到分析物分子上 。 在超声波的作用下基质膨胀，分析物被膨胀的基质捕获。,MALDI,与ESI不同，MALDI 产生的分子离子只带一个电荷。 正离子检测方式：M + H 负离子检测方式：M - H 比ESI方法有效 （tolerates salts and nonvolatile components） 容易使用与维

5、护 样品的需求量 10 L ，浓度 1 pmol/L,MALDI Sample Limits,磷酸盐缓冲液 50 mM 重碳酸铵 30 mM Tris buffer 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) 1 M Triton 0.1% SDS 0.01% 碱金属盐 1 M 甘油 1%,MALDI 基质应具有的特性,能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用（如形成共结晶）； 能溶解于可溶解样品分子的溶剂； 在真空状态下是稳定的； 可吸收激光，既与激光形成共振吸收； 可激发样品分子离子化。,样品引入方式 直接进样 优点： a) 快速获得分子量的信息； b) 快速获得混合肽的肽谱。,缺

6、点: a) 金属离子干扰, Na, K； b) 离子源结构复杂； c) 没有LC/MALDI 接口； d) 实现MS/MS 困难； e) 需要基质 质量范围 分子量小于500,000 Da,Comparison of ESI and MALDI,分析器,分析器,在蛋白质组学研究中，目前有三种分析仪（analyzer）搭配ESI/ MALDI source使用，分別是： triple quadrupole（三级四极杆） ion trap（离子肼） quadrupole-time of flight（四极杆-飞行时间）,质量分析器,磁质谱仪 （magnetic-sector mass spectr

7、ometer） 经典质量分析器：带电粒子在磁场中运动受到罗伦兹力的作用转弯,m: 离子的质量 z: 离子所带电量 V: 离子飞行速度 B: 磁场强度,r,若固定加速电压U，连续改变磁场强度B，称为磁场扫描； 若固定磁场强度B，连续改变加速电压U，称为电场扫描（常用）。,空间串联质谱仪,MS/MS,优点： a) 高重现性(稳定性)； b) 最好定性分析工具； c) 可以实现高分辨； d) 高灵敏度； e) 宽的动态范围； f) 可以实现多级质谱的串联； g) 高能collision-induced dissociation (CID) 谱重现性好。,缺点: a) 不能较好的与脉冲离子化技术联用(

8、如: MALDI)； b) 造价高，体积大； c) 联动扫描MS/MS谱的分辨率低。 应用: a) 所有的有机质谱分析方法； b) 精确质量测量； c) 定量分析； d) 同位素丰度比的测量。,飞行时间质谱仪(Time-of-flight mass spectrometer),m为离子的质量，q为离子所带的电荷，L为离子飞行的距离，v为离子的飞行速度，V为离子的加速电压，z为离子所带的电荷数，e微电子的电量。,2,m,/,qU,2,L,v,L,t,m,/,qU,2,v,qU,mv,2,1,=,=,=,=,U L,质谱法结合数据库检索对蛋白质进行鉴定,肽质量指纹图谱（Peptide Mass F

9、ingerprinting, PMF）法鉴定蛋白质 每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量，而形成一个肽段分子质量图谱，这个图谱对蛋白质应该是专一的、特异的，因此称为肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)。 只需将实验获得的PMF 与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF 比对就可以鉴定该蛋白质。 比传统方法速度快、通量高，是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。 PMF 鉴定蛋白质是依赖数据库的。,Peptide Mass Fingerprinting,MEMEKEFEQIDKSGSWAAI

10、YQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPP

11、KRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT,intact protein,enzyme,peptide fragments,生物学信息学的检索,对PMF 的实验结果和理论图谱进行比较和评价，是将实验数据转换成具有生物学意义的结果的关键。 目前已发展了不少算法和工具，这些软件都可以在互联网上免费使用，当然互联网上的软件使用的都是公用数据库。,Mascot查询结果,氨基酸序列质谱解析,碎片产生的

12、模式,生物质谱仪可根据肽段的碎片离子之间的质量差进行氨基酸序列的推测。 生物质谱产生碎片离子的模式常采用CID、CAD、PSD等。,1、CID模式,离子经过电喷雾源在进入质量检测器前，施加一定的电压，使离子的运动速度大大提高，当离子与中性分子撞击时，发生如下反应： A+N（A+）* B+C+D+ A+：离子（母离子） N：中性分子如Ar、N2 （A+）*：激发态离子（含有过多能量的分子离子） B+、C+、D+：分子离子产生的碎片离子 缺点：碎片离子较复杂，图谱难以解析。,2、CAD模式,CAD与CID的原理一样，只是CAD采用串级质谱来实现分子离子产生的碎片离子的过程。,第一个四极杆质谱仪选择

13、单一的母离子进入第二级质谱仪，第二级质谱仪内充有惰性气体，母离子飞入时与惰性气体分子发生碰撞产生碎片，碎片离子再经第三级质谱仪得以检验。,3、PSD模式,PSD是常用于反射飞行时间质谱的一种碎片产生模式。 由于在离子的产生过程中，分子离子获得足够的能量，在飞向反射场的过程中发生断裂，释放出多余的能量。 质量大的离子具有较高的动能，能进入反射场较深的位置；而质量小的离子由于动能较小，只能进入反射场较浅的位置。,PSD测序,PSD mass spectrum of substance P in CHCA employing RE-TOF-MS. 15 kV accelerating potenti

14、al, 50 laser pulses averaged for each reflector voltage segment.,碎片谱图解析,由于蛋白质基本结构由肽键构成，肽键断裂的方式有ax、by、cz三种。 所产生的碎片离子分别为a、b、c、x、y、z六种类型。含有 N-terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z. 根据键能的大小，主要以b、Y型离子为主。,CID技术在肽测序方面的应用,含有 N terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z.,De n

15、ovo 蛋白质测序,CID分类,低能（Low Energy） CID特点: 反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器； 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和C terminal的碎片离子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 在碎裂过程中易丢失中性小分子NH3 和H2O， 分别形成 a*, b* 和 y* 和a0, b0 和y0。 高能（high Energy） CID特点: 反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分析器； 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和C terminal的碎片离子： x, y or z.

16、 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。,串联质谱测定多肽序列原理,蛋白质由20种氨基酸组成，一段3个氨基酸的肽有203种可能排列方式，4个氨基酸的肽有204种可能排列方式，一个特定序列的4肽出现的概率为1160000，所以五六个氨基酸残基的序列片段在一个蛋白质组中已具有很高的特异性，可以用来鉴定蛋白质。 y 、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨基酸的序列。 质谱方法不能分辨亮氨酸(L)与异亮氨酸(I)，二者为同分异构体，残基相对分子质量均为113.08406。谷氨酰胺(Q)与赖氨酸(K)的残基相对分子质量十分接近，分别为128.05858与

17、128.09496，需要质谱仪的质量分辨率和准确度十分高才能正确分析。,串联质谱测定多肽序列实例,核糖核酸酶B用糖苷内切酶除糖后，用Glu-C酶切，在酶切产物的肽指纹谱中，有一段m/z 4792.23的肽谱，其质量数与理论肽谱质量数不相符，后来经串联质谱分析，测得其部分序列为SAASSSNYCNQM，与理论序列比较后发现，此序列所在的酶切肽理论值与实测值相差203，恰好是一个N-乙酰氨基己糖的质量数，表明此肽上还连接有一个N-乙酰氨基己糖。,肽谱理论序列： 阴影标记的部分为串联质谱解析出的序列，方框内序列为天冬酰胺序列子，N为糖基化位点。 肽理论质量M+H+ m/z：4589.10 肽实测质量M+H+ m/z：4792.23 实测值与理论值之差为 4792.23-4589.10=203.13（N-乙酰氨基己糖质量数）,肽序列标签技术,串联质谱技术获取的肽序列谱图相对较复杂，需要计算软件帮助计算识别b、y等各系列离子，从谱图读出完整序列的解析较困难。 数据库检索鉴定蛋白质时，可用读出的部分氨基酸序列结合此段序列前后的离子质量和肽谱母离子质量，在数据库中查寻，这一鉴定方法称为肽序列标签技术 （peptide sequence