蛋白质氨基酸测定.ppt

1、蛋白质和氨基酸的测定,概述 凯氏定氮法 蛋白质的快速测定法 氨基酸总量的测定 氨基酸的分离与测定,概述,（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用 （2）食品中的蛋白质含量 （3）蛋白质系数 （4）蛋白质测定方法,概 述 （1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。 人体的酸碱平衡、水平衡的维持； 遗传信息的传递； 物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质 食品的重要营养指标。,(2) 食品中的蛋白质含量及测定意义,在各种不同的食品中

2、蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。,（3）蛋白质的性质,蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万数百万。 从组成上看：化学元

3、素C、H、O 、N（P、S、Cu、Fe）；它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来， 官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团 结论：含氮是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，蛋白质的量与氮含量的关系用蛋白质系数表示： 蛋白质系数每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，

4、牛乳及其制品为6.38。,（4）蛋白质系数,三鹿奶粉相关荣誉,中国名牌产品，中国驰名商标，国家免检产品，绿色食品，中国食品工业百强，农业产业化国家重点龙头企业，中国最具价值的品牌，国家第一批卫生安全食品 。,石家庄三鹿集团股份有限公司2008年9月11日晚则发布产品召回声明称，经公司自检发现2008年8月6日前出厂的部分批次三鹿婴幼儿奶粉受到三聚氰胺的污染，市场上大约有700吨。,三聚氰胺(melamine),是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，或称为2,4,6-三氨基1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生成三聚氰

5、胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部分亚洲国家，也被用来制造化肥。,三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66），加之其生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。,化学性质,

6、三聚氰胺呈弱碱性（pKa=8），可与多种酸反应生成三聚氰胺盐。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。,毒性：,以前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3克/公斤体重。据1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。,2007年中国徐州一家出口美国猫狗食物的企业在宠物食品中添加三聚氰胺来冒充蛋白质导致中美关系轩然大波 。 宠物食品污染事件的初步调查结果认为：掺杂了6.6%三聚氰胺的

7、小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的结论画上了问号。 导致美国大量宠物死亡，被FDA彻底封杀。（FDA，美国食品药品管理局）。,三聚氰胺的分子式是C3H6N6，即氮含量为2/3，按GB/T 5009.5-2003，食品中蛋白质的测定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白氮换算系数为6.38，即1的蛋白氮含量，折算蛋白质含量为6.38，这样加入3三聚氰胺就蛋白含量“达标”了。,（5）蛋白质主要测定方法有： 双缩脲法 染料结合法 酚试剂法 紫外分光光度法 水杨酸比色法 折光法 旋光法 近红外光谱法 目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法,凯氏定氮法 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白

8、质系数而求出蛋白质的含量 此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物,凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。 凯氏定氮法：常量法、微量法及改良凯氏定氮法,凯氏定氮法的原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫

9、酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。, 样品消化： 2 NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O 浓硫酸的作用： 脱水作用使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。,加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3380C 4000C） K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO

10、4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。,加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 消化完全指示：蓝绿色；, 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢

11、氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH4)2 SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀 吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8 X 10-10），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色蓝绿色 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O, 滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定, 蓝绿色灰红色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 讨论： 1、实验中用到哪些试剂？作用是什么？,适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 仪器、试剂: 500mL凯

12、氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用： 浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜 蒸馏用： 40%氢氧化钠溶液 吸收用： 4%硼酸 滴定用： HCl标准溶液 0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂,微量凯氏定氮法操作步骤 样品消化 蒸馏 吸收 滴定 样品消化 :准确称取一定量的样品至干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g（3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒轻轻摇匀，以45斜支于石棉网上用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明后继续加热微沸30min关闭电炉，取下烧

13、瓶、冷却转移至100mL容量瓶中，加水定容。,注意问题： 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈； 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全； 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫； 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。,思考： 1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？ 2、如何判断消化的终点？, 蒸馏与吸收： 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性

14、，加入数粒玻璃珠。 在接受瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。 指示剂变绿色后继续蒸馏10 min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min,蒸馏、吸收注意问题： （1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。 （2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。 （3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。 （4）冷凝管下端先插入

15、硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超过40，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将,冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 （5）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。 （6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。, 滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸

16、标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。,(4) 结果计算 式中 W蛋白质的质量分数，%； c盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V1空白滴定消耗标准液量，mL； V2试剂滴定消耗标准液量，mL； m样品质量，g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数。,思考： 1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和指示剂甲基橙？ 2、为什么在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管？如何洗涤？,常量法 消化：同“微量法” 蒸馏与吸收： 与微量法的不同？,滴定：用盐酸标准溶液0.1mol/L，其余同“微量法”。 3.计算：与微量法的不同？ 4.注意：同“微量法

17、”,分光光度法测定蛋白质含量 原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在pH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。 氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取经105干燥的硫酸铵0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,临用时用水稀释至0.1g/L,双缩脲法： 双缩脲的性质：当脲被小心地加热至 150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应 测定原理：蛋白

18、质分子中肽键（CONH）与双缩脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。 特点：简单快速，灵敏度低，常用于生物化学领域。,染料结合法： 原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。 适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食品。,水杨酸比色法 原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成兰色化合物，在660nm处比色测定，求出样

19、品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。,氨基酸的测定,双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 茚三酮显色法 氨基酸的分离及测定,蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。,氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。,氨基酸态氮的测定,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,双指示剂甲醛滴定法 原

20、理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，用间接的方法测定氨基酸的总量。,方法特点及应用 此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。 特别适合浅色样品的测定,试剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液 0.1%中性红50%乙醇溶液 0.1 mol/L氢氧化钠标准

21、溶液,操作方法 预处理：移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份 中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀 色为终点，记录V1 滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）： 另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录V2,式中 c 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; m测定

22、用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol,结果计算,说明及注意事项,1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸 2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃 取， 50水浴中萃取0.5h即可。液体样品可直接进行测定。 3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH 时的pH为8.59.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。,电位滴定法 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计插入反应体系中，用氢氧化钠标准溶液滴定，

23、依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 仪器： 酸度计、磁力搅拌器、碱式滴定管25mL 刻度吸管：10mL,试剂： 酚酞乙醇指示液：1% 甲醛：36%-38% 氢氧化钠标准溶液：0.05mol/L（标定）,试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL于烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V，可计算总酸含量）。, 加入10mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05m

24、ol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V1。 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V2 。,第一次滴定是除去其它游离酸，所消耗的NaOH溶液体积不用于计算氨基酸态氮，但可计算总酸含量）。 第二次滴定才是测定氨基酸，用消耗的NaOH溶液体积进行计算。 在测定过程中加入中性甲醛的作用是什么？,式中 W-氨基酸态氮质量浓度，%; c-氢氧化钠浓度，mol/L； V1-加入甲醛后耗NaOH的量，mL； V2-空白试验加甲醛后耗

25、NaOH量，mL； 0.014-氮的毫摩尔质量，g/mol； m-样品量，g,说明 本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定 对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。 结果要求精密度10% ，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。,平行实验与结果处理 平行实验是指在相同条件下同时做两份测定. 精密度是指同一样品的各测定值的符合程度。 如果两份之间相对误差不超过允许范围,说明该样品的测定在精密度方面是可靠的;如果相对误差超过允许范围,则应重做。在食品检验中,如果相对误差没有特殊规定,相对误差的允许范围一般20%,其计算方法如下: 相对误差(%)= 式中:A、B为

26、两次平行测定的结果。,茚三酮显色法 原理：水合茚三酮与氨基酸反应，水合茚三酮被还原成还原型水合茚三酮，氨基酸被氧化脱羧，产生醛、二氧化碳和氨。氨与水合茚三酮、还原型水合茚三酮作用生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比。 在570nm处测吸光度，用氨基酸标准溶液绘制标准曲线。 样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。,氨基酸的分离及测定 通常采用： 氨基酸自动分析仪 气相色谱法 液相色谱法,氨基酸自动分析仪分析,食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可

27、同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。,操作步骤,样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。 称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在1020mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。,水解：在水解管内加6mol/L盐酸1015mL（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚34 滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻35min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在1101的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50mL容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在4050干燥，残留物用 12mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mL pH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。,测定：准确吸取0.