《酶蛋白的结构》PPT课件.ppt

1、第三章 酶蛋白的结构,蛋白质的一级结构（primary structure） 蛋白质的二级结构（secondary structure） 蛋白质的三级结构（tertiary structure） 蛋白质的四级结构（quaternary structure）,蛋白质结构和功能的关系,举例：镰刀状细胞贫血病 镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。 镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体蛋白质

2、，由两个亚基和两个亚基组成（22），其中亚基包含141个氨基酸残基，亚基包含146个氨基酸残基。镰刀状细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的亚基N-末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度极性的Glu变成了非极性的Val,这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。,牛胰核糖核酸酶复性实验 8个CysSH形成4个二硫键的组合方式有753=105种，因而重新

3、形成正确配对的概率仅1/105，,第一节 蛋白质一级结构研究方法,1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 6.多肽链的局部断裂和肽段的分离 7. 测定各个肽段的氨基酸顺序 8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 9. 多肽链中二硫键位置的确定,1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 电泳单一带 SDS-PAGE测分子量（质谱法）,2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 末端分析法 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 氧化法 氧化法的优

4、点在于二硫键一旦拆开，不会重新形成连接，但在氧化过程中伴随着一些副反应，Met侧链被氧化生成亚砜，Trp侧链被破坏。 还原法 为了防止游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化,4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸 1）酸水解： 作水解程度时间图确定最佳时间 1-10mg蛋白样品 加HCl 抽真空 封闭 烘箱 特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质 b） Ser、Thr、Tyr部分破坏，Ser破坏10-15%，Thr、Tyr破坏5-10%，应予以校正 c） Asn Asp Glu Gln d） 胱氨酸半胱氨酸 e）

5、大部分氨基酸不破坏,2）碱水解： 特点：a)Trp不破坏 b）大部分氨基酸破坏,分离检测：1）纸层；2）薄层；3）离交；4）氨基酸自动分析仪,5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 目的：有几条肽链；N、C末端是何氨基酸 测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被保护试剂保护；末端是Pro 5-1 N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点） 1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法） a）原理：,b) 分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶 标准Aa + DNP反应纸层喷茚三酮 未知DNP-Aa纸层喷茚三酮 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优

6、点：反应条件温和，末端产物易分离 缺点：N端是Pro测不出；不能进行N端测序 Lys的另一氨基生成e-DNP-Lys，由于它不溶于乙醚故不影响测定结果,2) 丹磺酰氯法（DNS法） a) 原理：,b）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶 标准Aa + DNS反应纸层荧光显色 未知DNS-Aa纸层荧光显色 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，样品量为0.1-2ng 缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、Try测不出；不能进行N端测序,3) Edman降解法苯异硫氰酸酯法（PITC法) a) 原理： a

7、）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶 c）优点：N端是Pro可测；能进行N端测序 缺点：灵敏度稍差,4）DansyCl-Edman法 既可检测N端序列又有较高灵敏度,5) 亮氨酸氨肽酶法 此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测N端序列，但不能测N端为Pro.,5-2 C-末端分析 C-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。 1）肼解法 原理：,b）分离检测： 苯甲醛+酰肼沉淀离心 上清液中含游离基酸 2) 还原法 用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基的-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分析水解产物，其中的-氨基醇对应的即为C-

8、末端氨基酸。,3) 羧肽酶法 羧肽酶是一种专一从多肽链的C-末端开始逐个水解氨基酸残基的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，C-末端残基首先被水解下来，然后是C-末端第二个氨基酸残基，依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定C-末端氨基酸以及靠近C-末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定C-末端多个氨基酸的排列顺序。 羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解 b）C-末端是Pro不能水解 c）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解 羧肽酶B：a）水解C-末端为Lys、His、Arg的 b）C-末端

9、第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解,6.多肽链的局部断裂和肽段的分离 在氨基酸顺序测定时，只要从肽链某一末端（通常是N-末端）起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时，由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到100%，或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基，这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，这样测定将无法进行下去。所以人们首先需将肽链进行适当的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，

10、再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。,1溴化氰裂解法： BrCN：专一水解Met羧基形成的键 优点：专一性强，切点少，产率高（85%） * 弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好 2酶解法： 胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（Lys，Arg） * 碱性氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：专一性水解芳香族氨基酸羧基所形成的键（Phe，Try，Tyr）。 * 若芳香族氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。 分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）,7. 测定各个肽段的氨基酸顺序 测定肽段的氨基酸顺序的方法有：Edman降解法、酶解法、气相色谱质谱联用法等，其中最

11、常使用的是Edman降解法。 Edman降解法的原理是利用前述苯异硫氰酸酯（PITC），又称Edman试剂与N-末端氨基酸残基的-氨基之间的特异性反应，每轮反应后N-末端氨基酸脱落，并生成PTH-氨基酸。通过层析等方法鉴定PTH-氨基酸的种类，就可以确定肽链中对应位置的氨基酸。通过n轮反应，即可确定由肽段中N-末端起n个氨基酸的顺序。,8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 至此，已经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，必须用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两种蛋白酶分别水解多

12、肽链，将得到两套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以确定整条多肽链的氨基酸顺序。,通过末端分析得到：N-末端残基为I，C-末端残基为L 用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基酸顺序分别为： MTYAGK ISR EAL CAFR DALK 用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出氨基酸顺序分别为： TY REAL AGKDAL ISRM KCAF,由于N-末端残基为I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又由于C-末端残基为L，EAL和REAL是C-末端肽段。利用两套肽段的氨基酸顺序彼此之间的重叠关系，得出： 第一套肽段： N

13、-末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C-末端 第二套肽段： N-末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C-末端 推出完整肽链顺序： ISRMTYAGKDALKCAFREAL 在上例中，两套肽段之间正好能够相互跨过切口而重叠，从而能确定出肽段在多肽链中的位置，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。,9. 多肽链中二硫键位置的确定 对于含有二硫键的蛋白质，我们在分析多肽链氨基酸顺序前先将其拆开，然而在测定完多肽链氨基酸顺序后需要确定链内和链间二硫键的位置，常用的方法是对角线电泳法。不拆开二硫键直接用蛋白酶水解蛋白质，所得肽段样品点样到滤纸中央的电泳原点，在第一个方向上

14、进行电泳，则不同的肽段按其所带电荷和分子大小分离。结束后将滤纸在过甲酸蒸气中熏，二硫键被氧化和拆开。将滤纸旋转90，在相同条件下进行第二个方向上的电泳。这时，对于不含二硫键的肽段，由于没有发生变化，电泳迁移率不变，电泳后位置应处于对角线上；而含有二硫键的肽段，其大小和电荷发生了变化，电泳迁移率也要改变，电泳后位置偏离对角线，将这些肽段提取出来，进行氨基酸顺序分析，与已经测定的多肽链氨基酸顺序相比较，即可推断出二硫键的位置。,除了上述经典的蛋白质一级结构测定方法外，由于核苷酸序列测定技术发展迅速，目前DNA的核苷酸序列测定已完全实现自动化，而蛋白质的氨基酸顺序是由DNA所决定的，人们通过提纯指导

15、蛋白质合成的mRNA，再将mRNA通过逆转录作用得到cDNA，并扩增cDNA，然后测定其核苷酸序列，根据三联体遗传密码规则可确定出蛋白质的氨基酸顺序。 到目前为止，已有10万种以上的蛋白质完成了一级结构的测定，对于大多数常见蛋白质，通过查阅数据库，可得到关于一级结构的资料。,第二节 蛋白质空间结构的研究方法,二级结构：a-螺旋（a-helix) ；b-片层(-sheet) ； b-转角(-turn) ；无规卷曲(random) 维持键：氢键、疏水键、范德华力、离子键、配位键等 R基团对a-螺旋的影响：a) 构成a-螺旋要求R不太大，不带电荷 b）几个相连的氨基酸的R带同种电荷，不形成a-螺旋

16、c）R带电荷但间断，可形成a-螺旋,*= -57，= -47是形成a-螺旋的条件，不满足此条件不能形成a-螺旋 *Gly不参与a-螺旋，原因：Gly的a-C上连两个H，故、无法确定 *Pro、Hyp不参与a-螺旋，原因：不形成角；空间障碍不形成氢键 = -119，= +113时，蛋白质分子成平行的b-片层 = -139，= +135时，蛋白质分子成反平行的b-片层 从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。,三级结构 二级结构进一步卷曲形成,具有三级结构的蛋白一般为球形或椭球形 纤维蛋白具有超二级结构(超螺旋) 四级结构 具有独立的三级结构间的结构,晶体蛋白测定 X光衍射古老的方法，1958年英国

17、科学家开始运用，分辨率6A0，目前分辨率1.4A0，我国X光衍射仪分辨率1.8A0，测胰岛素结构。 缺点：只能测晶体，不能测溶液。 不能测氢原子位置，故测不出氢键的作用。 只能测静态酶结构，无法测酶催化反应的动态。 目前有较新的实验方法中子衍射。,溶液中构象的测定 a) 紫外吸收法（常用方法）：Try，Tyr，Phe在紫外波长范围有最大光吸收，产生紫外吸收光谱。受pH、溶剂或邻近分子、邻近发色团的相对取向影响。 目前用紫外吸收法可以探讨下列问题： 芳香族氨基酸在表面？在内部？极性环境？非极性环境？数量？(氨基酸由极性到非极性，上升。极性溶液中，氨基酸在蛋白中，大于游离时，一定在蛋白内部且被非极

18、性氨基酸包围。极性变化对，影响大，氨基酸一定在表面。） 外界条件影响，二级、三级结构有无变化？变化过程？,b) 荧光光谱法 Tyr，Try，Phe能发射荧光。最大荧光强度波长为348nm、303nm、282nm，发光强度Try：Tyr：Phe=100：9：0.5。故一般以Try为准，荧光的灵敏度是紫外的103104倍。 用荧光光谱法可研究蛋白质分子的构象变化、酶活性部位结构、Try和Tyr残基的微环境、蛋白质变性。 蛋白位于极性溶剂时，max短波，Try进入蛋白内部非极性区。 蛋白位于非非极性溶剂，max短波，Try到蛋白表面。 紫外测值，纯酶需配成0.5mg/ml 荧光测值，纯酶需配成0.0

19、35mg/ml 研究酶活性部位一般要引入一个荧光探针.此试剂要求与酶结合牢固、不影响底物结合。探针在水中，荧光很小；在非极性中增大。 例：酶+荧光标记的底物：荧光强度上升，峰值移向短波, 酶活部位是疏水区,c) 园二色谱法（CD谱） CD光谱图：远紫外区185nm245nm，吸光是肽键所致，故可看出主链，可算出-螺旋、-折叠的含量。 近紫外区245nm320nm，吸光是Tyr、Trp、Phe所致，故可看出芳香族氨基酸所在的微环境。,至今为止人们还无法做到直接观察蛋白质分子中原子和原子团的排列，光学显微镜的最大分辨率在0.2m，而蛋白质分子内各原子之间的距离在0.1nm左右。目前人们对蛋白质的空

20、间结构进行研究都是借助于一些辐射方法，常见的包括X-射线衍射法、核磁共振、荧光光谱法、旋光色散、圆二色性、拉曼光谱、扫描隧道显微技术、原子力显微技术，等等。,例1 氨基酸组成 Phe+Pro+2Lys+Glu Edman降解 PTHGlu，胰酶，羧肽酶A、B均不可水解成氨基酸或小肽，求顺序。,例2：A肽经酸解得 : Lys+His+Asp+2Glu+Ala+Val+Tyr+2NH3。 经FDNB得DNPAsp 经羧肽酶得Val 经胰酶得（1）Lys+Asp+Glu+Ala+Tyr（PH6.4是等电点）（2）His+Glu+Val（PH6.4带+电荷） （2）经FDNB得DNPHis。 经胰凝乳

21、蛋白酶得（1）Asp+Ala+Tyr（PH6.4中性） （2）Lys+His+2Glu+Val（PH6.4带+电荷） 求顺序。,例3（1）肽经酸解得Try+Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Pro （2）肽经FDNB法得DNPAla -DNP-Lys （3）肽经羧肽酶A不能测出C-末端氨基酸 （4）肽经羧肽酶B不能测出C-末端氨基酸 （5）肽经溴化氰得Ser+Try+Pro；Ala+Arg+Ser+Lys+Phe+Met （6）肽经胰凝乳蛋白酶（chT）得Ser+Pro；Met+Try；Phe+Lys+Ser+Arg+Ala （7）肽经胰酶（T）得Ala+Arg；Lys+Ser

22、；Phe+Try+Met+Ser+Pro 求顺序。,例 1 答案：Glu-Phe-Lys-Pro-Lys 解法：PTHGlu N-末端为Glu，胰酶不水解故有LysPro 羧肽酶A不水解：Lys为C末端，Pro为C末端，Pro为C末端第二。 羧肽酶B不水解：Pro为C末端第二。 故Pro为C末端第二。 故有Glu-Phe-Lys-Pro-Lys或Glu-Lys-Lys-Pro-Phe 若是后一种胰酶可将其水解成Glu-Lys，Lys-Pro-Phe，而实验显示胰酶不水解，故只能是第一种情况。,例 2 答案：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val 解法：酸解说明Asp和2Glu中有两个是以酰胺状态存在 FDNB得N-末端是Asp 羧肽酶得C-末端是Val