第七讲 酶的非水相催化..ppt

1、第七讲 酶的非水相催化,讲课：阳飞,第七讲 酶的非水相催化,教学目标： 了解非水相中酶催化研究概况和反胶束体系的酶学研究情况 理解酶在有机介质中催化的反应的具体应用 掌握酶在有机介质中的催化特性 教学重点： 酶非水相中酶催化的影响因素、催化特性以及应用 教学难点： 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响,第七讲 酶的非水相催化,7.1、酶催化反应的介质,7.2、有机介质反应体系,7.3、有机介质反应体系影响因素,7.4、酶在有机介质中的催化特性,Go,Go,Go,Go,7.5、有机介质中酶催化反应的条件及其控制,Go,7.6、酶非水相催化的应用,Go,7.1 酶催化反应的介质,水是酶促反应最

2、常用的反应介质！,但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。 因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。,由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合、分解等副反应的发生。,是否存在非水介质能保证酶催化呢？,1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在“Science”上报道在有机介质中进行了脂肪酶催化反应的研究，成功地在利用酶有机介质中的催化作用获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。,？,酶非水相催化：酶在非水介质中的催化作用。,20多年来，科技工作者对酶在非水相介质中催化反应研究十分活跃，并取得突破性进展。在理论上

3、进行了非水介质（包括有机溶剂、超临界介质、气体介质、离子液介质等）中的酶的结构和功能、酶的作用机制以及酶的催化动力学等方面的研究，初步建立起非水相催化的理论体系。 非水相介质中的酶催化作用的应用研究也取得了显著成果，例如利用脂肪酶在非水介质中改良油脂等方面的工业化应用。,酶非水相催化的新特性和优势：,催化水不溶性化合物的转化，使酶的作用底物范围大大拓宽 改变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行，催化水解反应的酶可催化合成反应的进行 酶在有机溶剂中由于水分子的减少，象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点，减少或防止由水引起的副反应 酶的热稳定性大大提高，反应后易于回收和重复利用

4、 可避免长期反应中的微生物污染 可方便地利用对水分敏感的底物进行反应 可扩大pH值的适应性 当使用挥发性溶剂作为介质时反应后的分离过程能耗降低,酶非水相催化的类型：,1、有机介质中的酶催化 2、气相介质中的酶催化 3、超临界介质中的酶催化 4、离子液介质中的酶催化,1、有机介质中的酶催化,指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用对象：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质 应用：生产多肽、酯类、功能性大分子、手性药物的拆分 优点： 有机底物在有机溶剂中有较大的溶解度 酶的热稳定性和储存稳定性比水中明显提高 使某些反应过程的热力学可以向期望的方向移动 可以发生水溶液中不可能进行的反应，

5、如脂肪酶催化酯交换和酯合成反应等 表现出比水溶液中更具有“刚性”特点；酶不溶于有机溶剂，利于酶的回收与再利用 由于有机溶剂的存在，水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应（酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移）,国内外研究进展：,用酶催化转酯反应拆分外消旋体得高光学纯度对应体 在酶促反应体系中添加-糊精可提高对映体的纯度 枯草溶菌素有效催化合成氨基酸及肽的转酯等 杨波等提出了有机溶剂中在脂肪酶的催化作用下含手性中心碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则 李志远等用胰脂酶在有机介质中催化反应得到高光学纯度的2-氨基丙醇（R-）和（S+）对映体 宗敏华等探讨了超声辐射对有机相中脂肪酶催化有机硅醇

6、与脂肪酸反应的促进作用 刘平等研究了有机溶剂中酶催化合成五肽前体的反应,2、气相介质中的酶催化,酶在气相介质中进行的催化反应。 适用对象：底物是气体或者能够转化为气体的物质 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点，但是这方面的研究并不多。,3、超临界介质中的酶催化,酶在超临界流体中进行的催化反应。 超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体。 超临界流体的物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间： 黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质的扩散 扩散系数接近于气体，通常是液体的近百倍，可迅速渗透到物体的内部而溶解目标物质，快速达到

7、萃取平衡,应用：酯化、酯交换、醇解、水解、氧化反应,常用的超临界流体有CO2、C2H4、SO2、C2H6、C3H8、C4H10等。 常用的超临界流体以CO2最为常见，主要由于它临界条件温和，利于酶保持生物活性。 但也有人认为对某些酶促反应CO2也不是一种良好的溶剂： 因为它是非极性的，对极性底物的溶解度较低不利于反应进行 可以改变酶周围微水环境的酸度 与酶蛋白表面的自由氨基酸生成共价络合物而降低酶的活性,超临界介质酶催化的特点：,改变酶的底物专一性 区域选择性和对映体选择性，增强酶的稳定性 对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响 具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性 超临界温度

8、不能太高太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近 超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用 超临界流体要容易获得，价格便宜,4、离子液介质中的酶催化,酶在离子液中进行的催化作用 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。 如1,3-二烷基咪唑类和N-烷基吡啶类。 特点： 离子液没有可观蒸汽压，挥发性低 具有良好的热稳定性、区域选择性、立体选择性及键选择性 可以调节离子液的极性、疏水性和溶解性能，能溶解多种混合物，与多种溶剂组成两相体系,研究情况：,Magnuson等研究表明硝酸乙基胺（体积分数为10%）对从

9、E.coli中提取碱性磷酸脂肪酶具有活化作用 Erbeldinger报道了嗜热菌蛋白酶在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸中转化率可达40% Sheldon等研究表明南极洲假丝酵母脂肪酶B在离子液PF6 、BF4中跟有和传统有机溶剂有相同的催化速率,小 结：,在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。 研究表明酶在适宜的有机溶剂中具有与水中可比的催化活性： 水解酶： 氧化还原酶： 转移酶：,酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等,过氧化氢酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等,醛缩酶,7.2、有机介质反应体系,1、非极性有机溶剂酶悬浮体系 2、与水互溶的有机

10、溶剂-水单相均一体系 3、非极性有机溶剂水两相/多相体系 4、胶束体系,(微水介质体系),正胶束体系 反胶束体系,不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水，都对催化反应有显著的影响。,1、非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系),用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中，但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%) 酶的状态为结晶态、冻干状态、沉淀状态或者吸附在固体载体表面上,2、与水互溶的有机溶剂-水单相均一体系,有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系，酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 由于极性大的有机溶剂对一般没的催化活性影

11、响较大，所以能该反应体系中进行催化反应的酶较少。 主要研究集中在辣根过氧化物酶在此均一体系中催化酚类底物聚合生成聚酚或聚胺类物质，这些物质主要用于环保胶黏剂、导电聚合物和发光聚合物等功能材料的研究开发。,3、非极性有机溶剂水两相/多相体系,由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机相。 如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在于两相的界面，催化反应通常在两相的界面进行。 一般适用于底物或者产物两者或其中一种属于疏水性化合物的催化反应。,4、胶束体系,胶束也称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混

12、溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油(0W)的微小液滴。 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，既能溶解水溶性物质又能增溶疏水性物质。,正胶束是通过表面活性剂的极性端朝外与水结合，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部，形成一个非极性的核心形成，如图(a)所示。正胶束体系中水相是连续相，有机相(油相)是分散相。酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在胶束的两相界面中进行。,反胶束是由水表面活性剂有机溶剂所组成的低水含量的油包水(WO)微乳液。它是一个宏观均匀、微观多相的热力学稳定体系，该体系是一种两亲介质，既能溶解水溶性

13、物质又能增溶疏水性物质，其中有机相(简称油相)是连续相，水相是分散相，油相与水相之间通过表面活性剂单分子层隔开形成球状的反胶束微粒，如图 (b)所示。,分析反胶束体系应用较广的原因？,反胶束体系中表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，与非极性的有机溶剂接触，从而形成一个极性核心，水溶液包在胶束核心内部，酶分子在反胶束内部的水溶液中，也有的附着于反胶束内膜上，有的甚至部分伸入膜中。当酶在其中起催化作用时活性保持不变，同时包埋于反胶束中的酶，不仅避免了与周围有机溶剂直接接触而可能导致的失活 高度分散的反胶束提供了巨大的相界面积，使得通过反胶束内外间的传质阻力变得很小，特别是当产物为非水溶性时，其一

14、经形成即转入有机相而远离酶，可有效地减弱其对反应的抑制,反胶束体系,溶剂： 非极性有机溶剂，常用的是六碳以上的直链及支链烷烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二乙醚），其中正辛烷或异辛烷用得最多 表面活性剂： 阳离子型(CTAB：溴化十六烷基三甲基胺) 阴离子型(AOT：2-乙基己基-琥珀酸酯磺酸钠) 非离子型（Tween系列） 两性型（卵磷脂）,反胶束微粒的大小：,取决于反胶束的含水量(Wo)。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。 反胶束体系中的水通常可分为结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水

15、；自由水即为存在于水相中的那部分水。 研究表明不同的酶有不同的最适Wo值，该值取决于表面活性剂和酶的性质，即反胶束的内核体积与酶分子体积要相适应。 酶活力与W0的关系一般符合钟形曲线。,分析反胶束体系的优点？,具有组成灵活、热力学稳定 漆酶在反胶束体系中的活性约为水中的60倍 过氧化物酶约为水中的100倍 酸性磷酸酶约为水中的200倍 界面积大，可通过相调节来实现产物回收，既能为反应物和产物提供有机相，又能为酶分子维持其活性提供稳定的微环境。,反胶束体系的应用：,近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是肽的合成和脂肪酶的催化反应： Xing等研究了AOT正辛烷的反胶束体系中-胰凝乳蛋白酶催化

16、合成肽衍生物的反应得到5688的产率，而且还对反应体系的Wo值、反应时间和酶浓度等条件进行了讨论； Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽； Tsai等研究了AOT异辛烷磷酸盐缓冲液中脂肪酶催化油脂水解反应时表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响； 李干佐等研究了AOT异辛烷水体系中解脂假丝酵母脂肪酶催化庚酸和庚醇的酯化反应动力学； Rees等研究了阳离子表面活性剂CTAB的反胶束体系中有色黏性细菌脂肪酶催化癸酸辛酯的合成； 马成松等还研究了辣根过氧化物酶在AOT水异辛烷中多底物酶促反应等。,反胶束酶体系的制备方法,(1)注入法： 将含有酶的水相注入到含有表面活性剂的有机相中（最常用）

17、 (2)液体萃取法： 将含酶的水相与含表面活性剂的有机相直接接触（过程较慢） (3)固体萃取法： 将酶固体粉末与含水反胶束有机溶剂一起搅拌（时间长，易变性）,酶在反胶束体系中的活力,酶在反胶束体系中的活力主要由三方面的因素决定：核心水团的大小、表面活性剂的种类及反胶束微粒的浓度。 由于反胶束模型和组成对酶活性有影响，调节反胶束的特性可使酶更适合于特定的反应，提高反应速度。研究者认为反胶束相当于一个微反应器，它对水溶性底物有浓缩作用，使底物在核心水团中的实际浓度远高于在水溶液中的浓度，从而产生“超活性”。 近几年，有人提出是由于表面活性剂膜引起了酶分子构象刚性的增加及胶束中结合水的特殊性质共同影

18、响造成的。,反应体系对酶酯化反应的影响,反应体系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mM，戊酸10 mM，内标正十五烷， 脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应 1：水饱和正已烷10 ml，2pH7.2缓冲液5 ml+正已烷10 ml,7.3、有机介质反应体系影响因素,1、反应体系中水对酶催化反应的影响 2、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响,1、反应体系中水对酶催化反应的影响,一般蛋白酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。 有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反

19、应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。,总体来讲，水在酶催化反应中发挥着双重作用：,一方面，水分子直接或间接地通过氢键、疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象。 Gupta认为无水条件下酶分子的带电基团和极性基团之间相互作用，形成一种非活性的“封闭”结构，水的加入可削弱这种相互作用，使非活性的“封闭”结构变得“疏松”，酶分子的柔韧性增加，并通过非共价作用力来维持酶的催化活性构象，与酶分子紧密结合的一层左右的水分子，对酶的催化活性是至关重要的（必需水）。 不同酶与必需水结合紧密程度及所结合的必需水数量是不同的。 糜蛋白酶在辛烷中催化反应时需

20、50个水分子 多酚氧化酶、酪氨酸酶、醇脱氢酶等则需要几百个水分子,另一方面，水是导致酶的热失活的重要因素，有水存在时，随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活： 形成不规则结构 二硫键受到破坏 天冬酰胺和谷氨酰胺水解转化为相应的天冬氨酸和谷氨酸 天冬氨酸肽键发生水解 因此，在有机介质的酶催化体系中，存在着最佳含水量，该最佳含水量不仅取决于酶的种类，也与所选用的有机溶剂有关。,有机溶剂中酶活性与含水量的关系,大量实验表明，酶的催化活性与加水量的关系总是呈曲线形，而且大都为钟罩形。,水活度(Aw),在有机介质中含有的水主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。

21、研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。在结合水量不变的条件下，体系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。因此可以认为，在有机介质体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素，而水含量却受到酶分子以外的各种因素影响。 为了更为确切地反映水与酶催化活性的关系，Halling提出用水活度(Aw)来描述水对酶催化特性的影响。,Aw定义：在一定的温度和压力下，反应体系的水蒸气压和纯水的蒸气压之比，直接反应了酶分子上水的多少，与其他因素无关。即：Aw=P/Po；式中，P表示在一定温度和压力下反应体系中水的蒸气压；Po表示在相同条件下纯水的蒸气压。 当体系达到平衡态时，体系中各部分的

22、Aw值相等。 由于有机介质酶促反应体系中水的重要作用，可以通过体系中含水量的不同，使反应向着所期望的方向发展。一方面可以通过调节含水量，影响酶的水化程度及物理状态，使酶根据需要表现出不同的催化活性；另外还可以通过改变体系中的Aw而改变反应的平衡点。,1、添加法 2、去除法,体系中水含量的有效控制的方法：,直接加水法 预平衡法,敞口自由挥发法 通惰性气体或干燥空气来带走反应过程中产生的水 渗透蒸发法 水合盐对法,在反应的初期向反应体系中添加适量的水（最早和最普遍采用） 对反应过程中没有水产生的体系非常适用 但对副产物产水的体系不适合：如脂肪酶和蛋白水解酶等在非水介质中分别催化酯合成和肽合成反应，

23、随着反应的进行不断产生水并且进入反应体系,直接加水法：,预平衡法：,将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液形成的气相环境中进行预平衡，不同的饱和盐溶液对应不同的蒸气压，将酶与盐的饱和溶液平衡，同时将含有底物的溶剂平衡至相同的Aw，然后混合进行反应。 采用这种操作方式，在反应过程中Aw是否维持恒定是值得注意的问题。通常有两种情况可能会引起Aw的改变：在反应过程中产生或消耗水；溶剂化作用和相行为。其中由相平衡导致的Aw的改变较为复杂，只有当水在两相之间及两者混合物中的活度系数有严格的相关性时，Aw在混合前后才会保持不变，否则，将分别进行预平衡的底物和溶剂相混合时Aw会发生改变。,敞口自由挥发法： 由于反

24、应体系中有机溶剂更容易挥发，不宜采用采用 向反应体系中通惰性气体或干燥空气来带走反应过程中产生的多余的水： 一方面浪费能源、成本高，另一方面不容易准确控制体系的水含量，操作过程并不要求除掉体系中所有的水，而是控制体系水含量稳定在一个非常狭小的范围内，而且体系中的反应介质和底物也可能被带走，不容易被广泛接受； 渗透蒸发法： 即通过均一的非多孔膜来实现体系中水的转移，可以连续除去反应过程中生成的水，从而使反应平衡向合成方向移动，适用于大规模生产,水合盐对法：,通过直接向反应体系中加入水合盐对来控制体系水含量，一种水合盐对可得到一个特定的水蒸气压，不同的水合盐对产生相应的水含量。由水合盐与其无水形式

25、构成的盐对可以对体系中的Aw起缓冲作用。 以Na2HPO4为例说明其作用原理，体系中加入Na2HPO4，假定反应过程中有水生成，当反应进行到一定程度，体系中积累足够多的水时部分Na2HPO4结合水形成Na2HPO42H20形式，从而体系中的盐以Na2HPO4Na2HPO42H20盐对的形式存在，随着体系中水的积累，无水盐不断转化为二水盐，在全部转化之前体系Aw不变。当无水盐全部转化为二水盐后，水的进一步产生和积累会引起体系Aw的提高，直至水的量足以使二水盐转化为七水盐，形成Na2HPO42H20Na2HPO47H20盐对，从而将体系Aw维持在另一水平。,讨论：水活度对酶活性的影响,（1）通常最

26、佳水含量会随着溶剂极性增加而增加 （2）酶因为结构不同导致维持酶所具有的活性构象所必需的水量也不同 （3）酶中水的位置也要正确 （4）酶活性位点的运动性随着水的加入显著增加 （5）蛋白质分子的极性和带电基团的水合作用对于酶的催化是必要的,（1）通常最佳水含量会随着溶剂极性增加而增加,溶剂和底物性质对酶活性也有着直接或间接的影响，底物对水也有强的吸附作用。 Martins等研究表明溶剂的极性由己烷变成戊醇时最佳水活度与溶剂的极性几乎无关，大约在0.55左右 -胰凝乳蛋白酶在NaCO310H2O水合中仍能催化肽合成，但酶、底物、产物以及水合盐均不溶于溶剂中 脂肪酶在己烷中催化丁酸和丁醇的酯化反应时

27、，当反应物浓度增加到0.37molL时得到一个恒定的最佳水活度0.78,（2）酶因为结构不同导致维持酶所具有的活性构象所必需的水量也不同：, 大部分酶需要较高的水活度才能表现出较好的活性： -葡萄糖苷酶、酪氨酸酶Aw0.7才能测出催化活性 -胰凝乳蛋白酶每个分子需要数十个水分子活化 酪氨酸酶、醇脱氢酶每个分子需要几百个水分子活化 同一种酶来源不同所需的水量也会有显著不同： Rhizopus arrhizus脂肪酶（低Aw） Pseudomonas sp.脂肪酶（随着Aw的增加活性提高） Candida rugosa脂肪酶（Aw较宽） 在不同的反应中酶所需要的最适水量也不同： 酯化反应中，水作为

28、酰基酶的一个亲核试剂与醇底物竞争，随着水活度的增加，酶底物的Km值会提高许多倍(1020倍)。,（3）酶中水的位置也要正确： 枯草杆菌蛋白酶经超声波处理后酶活显著提高，可能是由于结合在酶蛋白中的水分子重新排布造成的 （4）酶活性位点的运动性随着水的加入显著增加 （水能提高蛋白质结构区域的柔性及其活性位点的极性）： 乙醇脱氢酶、枯草杆菌蛋白酶、四氢呋喃中细胞色素C、胶原蛋白、弹性蛋白、溶菌酶,（5）蛋白质分子的极性和带电基团的水合作用对于酶的催化是必要的：,由于在干的状态下，酶分子的带电基团和极性基团互相作用产生一个失活的锁住的构象，水与这些功能基团形成氢键，屏蔽离子化基团之间的静电作用，并且中

29、和了折叠多肽链中的肽单元和极性侧链基团之间的偶极相互作用。 静电相互作用在控制有机介质中酶的催化行为方面可能起主要作用。通过向溶剂中加入各种“氢键形成物”(例如甘油、乙二醇和甲酰胺)验证了这个假设，其中加入3甲酰胺会使在辛醇(含1水)中的多酚氧化酶的活性提高35倍。,2、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响,有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分之一。常用的有机溶剂可分为两大类： 水溶性有机溶剂： 甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等 水不溶性的有机溶剂： 石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等,讨论：反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响,（1）有机溶剂对酶结构的影

30、响 （2）有机溶剂对酶活力的影响 （3）有机溶剂对底物和产物分配的影响,（1）有机溶剂对酶结构的影响：,破坏酶的空间结构甚至引起酶的变性失活： 碱性磷酸酶： 悬浮于乙腈中20h，60以上的酶不可逆变性失活 悬浮在丙酮中36h，75以上的酶呈现不可逆失活 对酶的表面结构和活性中心产生一定的影响，但其整体结构和活性中心基本上保持完整： 脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等,讨论：有机溶剂本身对酶促反应的作用途径有哪些？,直接与酶发生作用干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或失活 与能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行 直接和酶分子周围水相互作用,枯草杆菌蛋白酶晶体原有119个

31、与酶分子结合水分子，悬浮在乙腈中后，与酶分子结合的水分子只有99个，有12个乙腈分子结合到酶分子中，其中有4个是原来水分子结合位点 辣根过氧化物酶在甲醇中催化时甲醇分子可以进入酶的活性中心与卟啉铁配位结合,一般认为在非水相反应体系中极性强的有机溶剂对酶的催化活性不利，因为它们会剥夺酶表面微环境中的必需水而使酶失活，所以在多数情况下，酶在疏水性强的有机溶剂中保持较高的活性 研究证明在非水介质中加入乙二醇、多元醇聚合物、大环有机物均可起到稳定酶或增强其活性及选择性的作用,（2）有机溶剂对酶活力的影响：,Laane深入研究了溶剂的理化性质与酶功能的相关性，其中包括希尔德布兰德溶解度参数()、介电常数

32、()、偶极距()以及分配系数的对数(lgP)等，发现lgP与酶活力之间具有最好的相关性：lgP越大，溶剂的疏水性越强;lgP越小，溶剂的亲水性越强。将常用的30多种有机溶剂根据其在水中的溶解度分为三类。,常用有机溶剂的分类及对酶活性影响规律,酶在不同性质有机溶剂中的催化反应研究结果表明，酶活力与lgP之间存在以下相关性：,在lgP2的极性溶剂中，酶具较低催化活力，极性溶剂会强烈地扰动水与催化剂之间的相互作用，导致酶二级结构（a-螺旋和-折叠）及高级结构出现脱稳而活性丧失； 在2lgP4的中等极性溶剂中，酶常常表现出中等催化活力，具有较弱的水扰动能力，影响的程度与酶的特性和体系性质有关； 在lg

33、P4的非极性溶剂中，酶有较高的催化活力，非极性溶剂通常不会扰动酶的必需水层。,（3）有机溶剂对底物和产物分配的影响：,酶在有机介质中进行催化反应，酶的作用底物首先必须进入必需水层，然后才能进入酶的活性中心进行催化反应。反应后生成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到有机溶剂中，而产物也必须移出必需水层，酶催化反应才能继续进行下去。有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。 如果有机溶剂的极性很小，疏水性太强，则疏水性底物虽然在有机溶剂中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催化速度 如果有机溶剂的极性过大，亲水性太强

34、，则疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也使催化速度减慢,7.4、有机溶剂对酶活性和选择性的调节,有机溶剂对酶活性的调节,有机溶剂对酶选择性的调节：,有机溶剂中酶结构的刚性增强，从而为有机溶剂调节酶功能提供了一种可能的手段，也即利用有机溶剂的性质来调节酶的选择性（溶剂工程）。 酶在不同介电常数的有机溶剂中，其分子结构刚性程度不同。 在低介电常数的有机溶剂（乙腈）中柔性要比高介电常数的有机溶剂（二嗯烷）中要高 在高介电常数的有机溶剂中时酶分子柔性降低，S-型异构体遇到的空间障碍减少，酶反应活性增大，导致酶的对映体选择性减小,7.5、酶在有机介质中的催化特性,酶在有机介质中起催化作用时

35、，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性：,底物特异性 对映体选择性 区域选择性 键选择性 热稳定性 pH“记忆”与pH “忘记”,底物特异性（底物专一性）,酶在水溶液中进行催化反应，具有高度的底物专一性，是酶催化反应的显著特点之一。在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性发生改变。有机溶剂具有不同的极性，所以在有机介质中，酶的底物专一性会发生改变。 胰蛋白酶等蛋白酶在催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯的水解反应时： 在水溶

36、液中，后者比前者催化水解的速度快104倍 在辛烷介质中，前者比后者催化水解的速度快20倍,对映体选择性,又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体能力大小的指标。酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数(KLD)的大小来衡量。 式中，KLD立体选择系数 LL-型异构体 DD-型异构体 Km米氏常数 Kcat酶的转换数,KLD=,Kcat,Km,L,Kcat,Km,D,酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。在手性药物的制造中有重要应用。 例如蛋白酶： 在水溶液中只水解含有L-氨基酸的蛋白质生成L-氨基酸 在有机介质中以D-氨基

37、酸为底物合成由D-氨基酸组成的多肽,区域选择,酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数Ks.t的大小来衡量。区域选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置s,t代替异构体的构型L，D。,Ks,t=,Kcat,Km,s,Kcat,Km,t,例如脂肪酶催化1，4-二丁酰基-2-辛基苯与丁醇之间的转酯反应: 在甲苯介质中，区域选择系数K4,1=2，表明酶优先作用于底物C4位上的酰基； 在乙腈介质中，区域择系数K4,1=0.5，则表明酶优先作用于底物C1位上的酰基。 从而得出在两种不同的介质中区域选择系数

38、相差4倍。,键选择性,即在同一个底物分子中有2个以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。 键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。 例如脂肪酶催化6-氨基-1-己醇酰化反应，底物分子中的氨基和羟基都可能被酰化分别生成肽键和酯键： 采用黑曲霉脂肪酶催化时，羟基酰化占绝对优势 采用毛霉脂肪酶催化时，氨基酰化占绝对优势 在不同的有机介质中，氨基酰化与羟基酰化程度也有所不同,热稳定性,许多酶在有机介质中热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。 胰脂肪酶在水溶液中100时很快失活；而在有机介质中，在相同的温度条件下半衰期却长达数小时。 酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关，通

39、常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低。 核糖核酸酶在有机介质中水含量从0.06gg蛋白质增加到0.2gg蛋白质时，半衰期从120min减少到45min 细胞色素氧化酶在甲苯中水含量从0.3增加到l.3时，半衰期从4h减少到1.7min,在有机介质中，酶的热稳定性之所以增加，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子 变性失活的水分子所致。因为水分子会引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用， 还可能会引起天冬氨酸肽键的水解、半胱氨酸的氧化、二硫键的破坏等。,某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性,pH“记忆”与pH “忘记”,在水溶液中，pH值是影响酶催化的重要因素。因为在水溶液中缓冲液的

40、pH值决定了酶分子活性中心基团的解离状态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和催化反应。 然而在有机溶剂中，不存在质子获得或丢失的条件，那么，在有机介质中，pH值是如何影响催化反应呢？,？,pH“印记”或pH“记忆”,在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶的冻干或吸附到载体之前所使用的缓冲液pH值相同。因为酶在冻干或吸附到载体之前，先置于一定pH值的缓冲液中，缓冲液的pH值决定了酶分子活性中心基团的解离状态。当酶分子从水溶液转移到有机介质中时，酶分子保留了原有的pH印记，原有的解离状态保持不变，即酶分子在缓冲液中所处的pH状态仍然保持在有机介质中。 酶在有机介质中催化反应的最适pH值通

41、常与酶在水溶液中反应的最适pH值接近或相同。 利用酶的这种pH印记特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。,pH“忘记”,由于受到有机相缓冲液的影响，控制着有机介质中酶的解离状态，使酶分子的pH“印记”特性不再起作用，酶完全“忘记”干燥前它所处的溶液pH。 研究表明，在含有微量水的有机介质中，某些疏水性的酸与其相对应的盐组成的混合物，或者某些疏水性的碱与其相对应的盐组成的混合物可以作为有机相缓冲液使用，以中性或离子对的形式溶解于有机溶剂中，这两种存在形式比例控制着有机介质中酶的解离状态。 有些酶在有机介质中催化的最适pH值与水溶液中催化的最适pH值有较

42、大差别，需要在实际应用时加以调节控制。,7.6、有机介质中酶催化反应的条件及其控制,1、有机介质中酶催化反应的类型,转移反应 醇解反应 合成反应 氧化还原反应 裂合反应,（1）转移反应,R1COOR2+R3COOH,R1COOR3+R2COOH,脂肪酶,转酯反应,酯酶,（2）醇解反应,R1-CH,CH2-C=O,CH2-C=O,+R2OH,O,R1-CH,CH2-COOH,CH2-COOR2,假单胞脂肪酶,(3)合成反应,R1COOH+R2OH,R1COOR2+HOH,脂肪酶,酯酶,R1CHCOOH+R2CHCOOH,H2NCHCONHCHCOOH+H2O,NH2,NH2,R1,R2,蛋白酶,（4）氧化还原反应,RCHO+NADH+H+,RCH2OH+NAD+,R1COR2+NADH+H+,R1CH(OH)R2+NAD+,醇脱氢酶,（5）裂合反应,RCHO+HCN,RCH(OH)CN,醇腈酶,2、有机介质中酶催化反应的控制,酶的种类和浓度 底物的种类和浓度 有机溶剂的种类 水含量 温度 pH值 离子强度,7.7、酶非水相催化的应用,1、手性高分子聚合物的制备,(1)聚酯的合成： 利用脂肪酶在甲苯