rna病毒感染性克隆技术及其应用

1、生物技术通讯 LETTERS IN-BIOTECHNOLOGY Vol.23 No.2 Mar., 2012271 doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.02.031综述 RNA 病毒感染性克隆技术及其应用 杨扬，谭文杰 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，病毒基因 工程 国家重点实验 室，北京 100052摘要 为 实现对 RNA 病毒基因分 子水平上的操作与 研究 ，可 将病毒基因组 RNA 体外转换成 cDNA ，构建 出 cDNA 克隆， 通过 cDNA 克隆与 重组技术实现对 RNA 病 毒基因分 子水平的修饰 ，从而 为 病毒基因组的结构和功能研

2、究提供有效的方法。 这种方 法是 现代实验病毒学非 常有用的工具，称 为 RNA 病毒感染性克隆技术或反向遗传学技术。 我们对该技术及其应用进行简要综述。 关键词 RNA 病毒；感染性克隆 ； 应用 中图分类号 Q78; R373文献标识码 A文章编号 1009-0002(2012)02-0271-04Infectious Cloning Platform for RNA Virus and its ApplicationsYANH Yang, TAN Wen-Jie*State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Enginee

3、ring, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, China CDC, Beijing 100052, China*Corresponding author, E-mail: Abstract To realize the operation and research of RNA virus genome at the molecular level, the viral genomic RNA could be converted into cDNA in vitro, th

4、en cDNA clones could be constructed by cDNA cloning and recom binant technology, so as to study the structure and function of viral genome achieved by the RNA virus genomic modification at the molecular level. This method is very useful tool in modern experimental virology, called infec tious clonin

5、g platform for RNA virus or reverse genetics. This infectious cloning platform for RNA virus and its ap plication were reviewed briefly in this paper.Key words RNA virus; infectious clone; applicationsR NA 病毒感染性克隆技术是利用病毒感染性c DNA 克隆研究 R NA 病毒结构与功能的一项新技术 ，包括病 毒基因组 全长 c DNA 克隆构建和病毒R NA 的感染性转录体 制备及导入。该技

6、术的发展实现了对R NA 病毒在分子水平上的操作，为 R NA 病毒基1 全长 cDNA 感染性克隆的构建1.1 基因组 全长c DNA 的获得基因组全长c DNA 的获得是感染性克隆的第一步，也是最关键的一步。获得全长 c DNA 的一般方因组的结构和功能研究提供了有效的方法。 1981 年， 步骤包括引物设计、覆盖基因组全长的相互重叠Racaniello 和 Baltimore 将包含脊髓灰质炎病毒全长c DNA 的质粒 DNA 转染宿主细胞 ，成功地构建了首个R NA 病毒的全长c DNA 克隆”。 获得 cD NA感 染性克隆后，可以 在 DNA 水平上通过突变、插入、缺失和互补等手段

7、研究 R NA 病毒的基因复制、表达、重组及 R NA 病毒与宿主的相互作用等。目前， 该 技术得到了广泛发展和应用，许 多 R NA 病毒的感染性克的cDN 段的 合成、与载体相连接 、根据酶切位点将片段拼接成 全长c DNA 。对于较小( 15 kb )的基因组，基本上都是采用此策略。 对于基因组较大的病毒，在 RT- PCR 过程中 ，随着 c DNA 链的不断延长，RT- PCR 的保真性不断下降，很难获得高保真性的 c DNA 克隆。采用高保真的逆转录酶及 DNA 聚合酶，能在很大程度上降 低错隆已获得，并已非常广泛 地应用于R NA 病毒结构功能、配率 ，提高 RT- P CR 的

8、保真性；同时，LA- P CR 的不断致病机制的研究及载体与疫苗研发等。 我们将对该技术及其应用进行简要综述。 收稿日期：2011- 06-10作者简介：杨扬(1986- ），男，硕士研究生 通信作者 ：谭文杰，（E- mail)成熟也在一定程度上解决 了该难题。 1994 年 ， Barnes将较高浓度的不具有外切酶活性的耐热 DNA 聚合酶和少量具有外切酶活性的 DNA 聚合酶混合， 利用前者的延伸能力和后者的校正能力，选择 2 类酶的适当比例和适当的反应条件，实现了对长片段 的扩增2 。 其基本原则是，以较高浓度的无外 切酶活 272生物技术通讯 LETT

9、ERS IN-BIOTECHNOLOGY Vol.23 No.2 Mar., 2012性的 DNA 聚合酶催化，同时以低浓度具 有 3,-+5 外切酶活性的 DNA 聚合酶修复在扩增反应过程中产生错配的核昔酸。该方法可用于快速构建基因组全 长 cDNA 的感染性克隆，与传统 方法相比，具 有扩增片段长、保真性高及省时省力的 优点 2- 4 。 染是惟一可行的方法。 克隆构建过程中，许多因素都能影响感染性转录体 的感染性气导致其下降甚至丧失。这些因素主要 在载体筛选过程中， 找到合适的能容纳较大外 有：心 非病毒核背酸序列。转录体 5 端的帽子结构源基因的载体是面临的另一难题。传统的载体主要 (

10、 m7GpppG) 对感染性的影响很大，要想获得好 的感包括质粒、粘粒、入噬菌体等，其容量非常有限。随后染性，帽子结构是必需的；转录体末端多余碱基也会在发展起来的人工染色体系统解决了这一难题。细菌 一定程度上影响其感染性。基因突变或缺失。 在整人工染色体( BAC) 是目前使用较多的大片段 DNA 克隆载体5 。 它是上世纪90 年代发展起来的一种以大肠杆菌F 质粒为基础的新型载体系统 ，具 有高容鼠、低拷贝、遗传特性稳定、转化效率高、易于分离纯化 及易千操作等优点5 。 经过多年的发展， BAC 载体已广泛用千基因组文库的构建及筛选、基因组测序、 新基因发现等方面。 用 BAC 系统已构建了

11、许多病毒的感染性克隆，如冠状病毒( CoV ) l6-1牛病毒性腹泻病毒( BVDV ) 等 8 ，特别是在大基因组的冠状病毒中得到了非常广泛的应用。 病毒基因组在菌体内的不稳定性是构建过程中 的又一难题。重组质粒在菌体内的突变和重组，以 及某些病毒基因组可能含有的毒性序列，会对细菌 产生一定的毒性 ，从而使 重组 DNA 不能稳定、正常地复制，最终导致病毒转录体失去感染性气有时可 以通过改换菌系或载体解决 ；或将病毒的 RNA 序列分段克隆到载体，经变性转录再将其连接成全长 cDNA 序列 ，避免毒性序列 在细菌中传代。另外 ，在病毒基因组内人为插入内含子以阻断cDNA 克隆对菌体的毒性也被

12、广泛运用 10-11 。 也有报道，通过采用低拷贝菌株（如大肠杆菌 Able K) ，或质粒在细菌 中扩大培养时用28C 替 换通常采用的 37C ，可明 显提高质粒在细菌中的稳定 性 1 2 。 1.2 感染性转录体制备个 过程中 ，很多步骤如 RT- PCR、限制性位点的引入、转录等都可能导致基因突变或缺失，如果突变或缺失发生在某些关键位点，则可能影响转录体的 感染性。转录体之间的差异。主要出现在大肠杅 菌 RNA 聚合酶系统 ，由于病毒基因组在体内和体外转录过程中容易提前终止，得到的 RNA 转录体并 非都是全长的，从而导致不完整的没有复制能力的转 录体与完整转录体竞相与宿主发生作用，影

13、响转录 体的感染性。转录方式。对于某些病毒，体外转 录与体内转录获得的恢复病毒的滴度是不同的。 1.3 细胞转染及感染性克隆的检测细胞转染的方法主要有磷酸钙转染 、DEAE葡方法。例如，磷酸钙转染技术和电穿孔转染技术都可将质粒导入细胞核内，不同的是磷酸钙转染技术可以使核酸在受保护的作用下进入细胞核，在需要转染入核的时候可选择这 2 种方法。另外 有研究表明，数小时的离心不会对哺乳动物细胞的生长性状 产生 影响 ，应用离心方法(Spinoculation) 可有效提高多种病毒对宿主细胞的感染效率。目前也有关于离心方法可以显著提高人偏肺病毒( hMPV ) 在单细胞层培养物中的感染性的报道气 一般

14、来说 ，获得的 RNA 病 毒的感染性应该以病获得感染性转录体的方法主要包括体外转录和 毒母本为对照。成功转染后可通过蚀斑、免疫荧光、 体内转录。 体外转录技术是利用RNA 聚合酶在体外将病毒基因组 cDNA 转录为基因组 RNA ； 体内转录技术是将含有病毒 cDNA 的表达质粒直接转入体内， 利用宿主的 RNA 聚合酶及转录系统 在体内进行转录与复制，得到具有感染性的转录物，然后装配成 病毒粒子。与体外转录相比，体内转录有自己的优 越性：心 通过此方法得到的 RNA 比较稳定 ，不易降解， 对环境依赖性低；该方法不需要体外转录过 程， 不需要像帽子类似物和 RNA 聚合酶等较昂贵的试剂；

15、体内产生的病毒 RNA 更接近千宿主细胞的mRNA ，细胞病变效应( CPE ) 及其他一些特异性指标来早期评价感染性转录体的感 染性。通过检测 TCID5o评价恢复病毒的毒力效价，并与天然病毒的毒力效价比 较。转染过程中，为了避免假阳性的出现，证明所获 得的感染性克隆确实来源于 cDNA 克隆，须设置必要的对照。另外，也可以在全长 cDNA 构建过程中引入一些基因标记， 随后在感染性克隆中， 利用 RT- PCR 检测相应的基因标记。 2 病毒拯救的效率可使病毒基因组的表达不依赖于病毒的过程。对于不能在体外培养细胞中复制传代的病毒， 如丙肝病毒( HCV ) 、戊肝病毒( HEV ) 等，体

16、外转录感 许多因素可以影响病毒的拯救效率，主要包括： 心病毒末端精确壳体化对于许多病毒拯救来说是必 杨扬等：RN A 病毒感染性克隆技术及其应用273须的，这可能 是因为 N 蛋白和 RNA 模板间的相互作用。在野生型 T7 启动子的作用下，5 端额外引入 3 个非病毒G 残基，会使得拯救效率下降甚至消失。RNA 病毒只在胞浆中增殖和转录，高效 表达特异的病毒蛋白，防止了宿主细胞 对外源性 RNA 的核酸剪切造成的不可预测的、有害的影响；般情况下胞 通过使用截尾的 T7 启动子转录得 到真正的病毒末端， 浆中的表达是短暂的，能防止长时间的基因替换，因 阻止非病毒 G 残基的引入； 利用丁型肝炎

17、病毒( HDV) 核酶5端 的自我剪 切功能来 生成精确的病毒3 端，可以 提高病毒拯救效率，因此在冠状病毒感染性克 隆 构 建 过 程 中 ， 常 在 poly ( A ) 后 面 加 上HDV- BGH1610 。 Ghanem 等通过优化 HDV 核酶 ，使得 狂犬病毒的拯救效率提高了 100 倍15 。被拯救的此可用于短期的基因治疗；基于病毒复制子的 RNA 病 毒载体能高效表达特异的病毒蛋臼，因此可以作为很好的疫苗传递系统。 3.4研制新型疫苗病毒载体疫苗相对于传统疫苗具有以下几方面 的优势 20 ： 首先 ，除了诱导出显著的抗体反应外，还RNA 模板的长度是另一个需要考虑的问题，模

18、板越长， 能诱发细胞毒性T 淋巴细胞 ，这对控制胞内病原体拯救的效率越低。合适的细胞系可以提高病 毒拯救的效率。模板的方向性。尽管转染产生基 因组RNA 的质粒 DNA 能成功完成病毒拯救 ，但是以反基因链 为起始模板的 拯救效率更高16 。 3 RNA 病毒的 cDNA 感染性克隆的 应用3.1 研究病毒的性质在感染性克隆技术出现之前，对 RNA 病 毒的研及癌症非常重要 ； 其次，T 细胞激活疫苗还能诱 发正对高度保守的抗原决定簇，这使得对同一病原体的 不同株同时提供保护成为可能。RNA 病毒感染性克隆的成功构建 ，为 RNA 病 毒载体疫 苗的研制和开发开辟了新途径。相对于较 大的 DN

19、A 病毒，RNA 病毒最重要的优势在于它对免疫系统不存在负调节作 用， 其主要应用包括新型减毒活疫苗及嵌合疫苗的研制等2 1- 22 。 究一直由于缺乏有效的手段而无法深入。RNA 病毒感染性克隆的构建，使得我们可以通过对 cDNA 克隆的操作，间 接实现对病毒基因组 RNA 的操作， 4 结语全长 cDNA 感染性克隆的构建，实现了对病毒基从而为病毒基因组的结构和功能研究提供有效的方 因组 RNA 的 操作，从而为 病毒基因组的结构和功能研法。通过基因缺失、插入、替换等方法，我们可以研 究提供了有效的方法，在未来载体应用、疫苗研 制、究 RNA 病 毒的蛋白和基因组功能、致病机理，以及有效地

20、确定病毒的关键毒力位点等。 3.2 建立动物模型可以利用 RNA 病 毒全长 cDNA 感染性克隆建立动物模型，通过重现病毒的生活周期和感染模式，研究其致病机制和病理生理特征。以人偏肺病毒为 例，在过去的几年时间里，人们建立过啃齿类动物和灵长类动物的hMPV 感染模型，其中包括仓鼠、非洲绿猴、恒河猴、黑猩猩等。研究者发现 hMPV cDNA基因治疗等方面将会有非常好的应用前景。当 然， 我们在利用该技术进行研究的同时，也要注意控 制其对周围环境的影响。通过反向遗传学，我们具 有了“设计“病毒的能力，与自然条件下的病毒混杂 或重组有可能产生一些新的病毒；同时也有报道称， 由全长cDNA 而来的病

21、毒比原毒株的毒力更强 23 。这是我们必须要加以重视的。 参考文献 感染性克隆能在这些模型动物的呼吸道复制，同时 它们还表现出对同源性或异源 毒的保护性，暗 示了先前感染了一种类型的 hMPV 可能会产生对该病毒其他类型的保护性气 3.3 构建新的基因工程栽体目前常用的大多是 DNA 载体系统 ，RNA 病 毒载体的开发和应用则为基因工程载体系统的研究提供 了另一种策略。RNA 病毒的几个特征让它们成为推动表达系统 发展的重要动力”8 1 9 : CD大多数 RNA病 毒的基因组较小( 7- 19 kb) ，有利于 cDNA 克隆的构建和操作；基因表达是在病毒的控制之下的，并 且复制转录不经过

22、 DNA 阶段，避免了将 cDNA 整合到宿主细胞 DNA 的 可能； 多 数感染哺乳动物的 1 Racaniello V R, Baltimore D. Cloned poliovirus complementa ry DNA is infectious in mammalian cellsJ. Science, 1981, 214:916- 919.2 Barnes W M. PCR amplification of up to 35 kb DNA with high fidelity and high yieldJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91(6):

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