第一章 蛋白质化学2011生技.ppt

1、,生物大分子 -蛋白质,第一节 蛋白质概论,一、 蛋白质的化学组成与分类1、 元素组成碳 50%氢7%氧23% 氮16%硫 0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮6.25 2、 氨基酸组成从化学结构上看，蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长链分子。,3、 分类,（1）、 按组成：简单蛋白：完全由氨基酸组成结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基） （2）、 按分子外形的对称程度：球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。,（3）、按功能分： 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素

2、、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 （4）、 蛋白质在生物体内的分布与种类 分布含量(干重)微生物 50-80%人 体 45%一般细胞 50%种类 大肠杆菌 3000种人体 10万种生物界 1010-1012,二、 蛋白质分子的构象与结构层次,蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。一级结构氨基酸顺序二级结构 螺旋、折叠、转角，无规卷曲三级结构 四级结构 多亚基聚集,三、 蛋白质功能的多样性 P160,1 酶 2调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白） 3物质运输（血红蛋白、Na+

3、-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体） 4贮藏（卵清蛋白、种子蛋白） 5 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白） 6.结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白） 7接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白） 8防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白） 9激素功能（胰岛素）,第一节、蛋白质的分子组,除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,一.氨基酸 1.氨基酸的结构和分类,各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。20种基本氨基酸按R的极性可分为非极性氨基酸、极性性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。,Amino acid,硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸是由终止密码子编码.,（

4、1）氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,脂肪族氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leu

5、cine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline,亚氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸

6、,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trptophan,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine 组氨酸 Histidine,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine,含羟基氨基

7、酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine 谷酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,（2）分类：,根据氨基酸的R基团的极性大小 可将氨基酸分为四类： 非极性中性氨基酸(8种)； 极性中性氨基酸(7种)； 酸性氨基酸(Glu和Asp)； 碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。,必需氨基酸：,成年人： Leu、Ile、Val、ThrMet、Trp、Lys、Phe婴儿期： Arg和His供给不足，属半必须氨基酸。必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能

8、合成这些氨基酸的碳架（-酮酸,2.非编码氨基酸与非蛋白氨基酸,(1)非编码氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。 (2)非蛋白氨基酸 L-Cit L-Orn D-Glu D-Ala D-Phe -Ala -氨基丁酸,3.氨基酸的构型、旋光性和光吸收,（1）、 氨基酸的构型 除Gly外，19种氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr和Ile的-碳原子也是不对称的，因此Thr、Ile各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体。如: L-苏氨酸D-苏氨酸L-别一苏D-别-苏构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。,（2） 、旋光性,20种氨基酸中

9、，只有Gly无手性碳。Thr、Ile各有两个手性碳。其余17种氨基酸的L型与D型互为镜象关系，互称光学异构体（对映体，或立体异构体）。 外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。 内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关,（3） 、氨基酸的光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，2

10、57=2.0 x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,4.氨基酸 的物理性质,-氨基酸是不挥发的白色结晶，熔点200-350，不溶于非极性溶剂，而易溶于水 (胱氨酸,酪氨酸除外) ，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。晶体溶点高离子晶格，不是分子晶格。不溶于非极性溶剂极性分子 （Pro）介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）水溶液中的氨基酸是极性分子。,二.氨基酸的离解性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。

11、在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 侧链不含离解基团的中性氨基酸， pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2

12、)/2,例题 有四种氨基酸, 其解离常数分别为:,问: 1.四种氨基酸的等电点分别为多少? 2.四种氨基酸在PH=7的电场中各向哪个方向移动?,氨基酸在等电点状态下，溶解度最小 pH pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。 pH = pI时，氨基酸净电荷为零 pH pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动 P132 Handerson-hasselbalch 公式pH = pK + Lg质子受体/质子供体,第三节 氨基酸的化学性质,(1)与茚三酮的反应（颜色反应）,NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物,反应要点 A.该反应由N

13、H2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 D. 测定范围：0.5-50g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）,应用： A.氨基酸定量分析（先用层析法分离） B.氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,(2)与甲醛反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法 A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一

14、个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸,应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与- DNP氨基酸区分和分离 首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸

15、 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法 Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定,Edman降解法的改进方法 - DNS-Edman降解法,用D

16、NS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量,（5）与亚硝酸反应,范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应,第四节 多肽,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,1、多肽的结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽; 由多个氨基酸组成的肽则称为多肽; 组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,1.氨基酸顺序:在多肽链中氨基酸残基的顺序排列. 2.N-端与C-端:含有一个游离的-氨基的一端称

17、为氨基端或N-端;含有一个游离的-羧基的一端称为羧基端或C-端。 3.氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,2 、 肽键,1.肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 2.组成肽键的原子处于同一平面。 3.肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 4.在大多数情况下，以反式结构存在,而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型,3 、多肽的性质,1. 熔点高 2.具有旋光性 3.具有双缩脲反应 4.具有紫外吸收 5.具有两性性质和等电点 6.颜色反应 如:黄色反应，是由硝酸与氨基酸

18、的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反应生成二硝基苯衍生物而显黄色。 7.其它反应,4 、天然存在的重要多肽,活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。 （1） 谷胱甘肽GluCysGly广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。 2GSHGSSG H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG,谷胱甘肽的生理功用： 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持

19、还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,（2） 短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。 L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val （3）脑啡肽（5肽）已发现几十种Met- 脑啡肽：TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。,(4)促甲状腺素释放因子（TRH）,第五节 蛋白质的水解,蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.,一.酸水解,1

20、.方法：常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。 2.优点：不容易引起水解产物的消旋化。缺点是Trp被沸酸完全破坏； 3.缺点：含有羟基的氨基酸如Ser或Thr有一小部分被分解；Asn和Glu侧链的酰胺基被水解成了羧基。,二.碱水解,1.方法：一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 2.优点：色氨酸在水解中不受破坏。 3.缺点：由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高；部分的水解产物发生消旋化。,三.酶水解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶 1.优点：应用酶水解

21、多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。 2.缺点：水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：,Trypsin ： R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。 专一性不如胰蛋白酶强,肽链,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1和R2R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin)：R2=苯

22、丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,分别从肽链羧基端和氨基端水解,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,例题 从一种真菌中分离得到一种八肽,氨基酸分析表明它是由Lys Lys Tyr Phe Gly Ser Ala Asp 组成,此肽与FDNB作用,进行酸水解,释放了DNP- Ala.用胰蛋白酶裂解产生两个三肽即(Lys Ala Ser)和(Lys Phe Gly)以及一个二肽.此肽与胰凝乳蛋白酶反应即放出自由的天冬氨酸,一个四肽(Lys Phe Ser Ala )及一个三肽.此

23、三肽与FDNB反应随后用酸水解产生DNP-Gly, 试写出此八肽的AA序列,一.蛋白质的一级结构,(1)组成蛋白质的多肽链数 (2)多肽链的氨基酸顺序 (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 。,第六节.蛋白质的结构,蛋白质一级结构的测定 一）.测定蛋白质的一级结构的要求,1.样品必需纯（97%以上）； 2.知道蛋白质的分子量； 3.知道蛋白质由几个亚基组成； 4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,二） 蛋白质测序的一般步骤,1. 测定蛋白质分子中多肽链的数目。2

24、. 拆分蛋白质分子中的多肽链。3. 测定多肽链的氨基酸组成。4. 断裂链内二硫键。5. 分析多肽链的N末端和C末端。6. 多肽链部分裂解成肽段。7. 测定各个肽段的氨基酸顺序8. 确定肽段在多肽链中的顺序。9. 确定多肽链中二硫键的位置。,测定步骤,1.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,2.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,2.多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为

25、二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开。蛋白质的多肽链被拆开后，将它分离纯化，一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法，兹不赘述。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,3.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍(HN=C(NH2)2HCl)存在下，用过量的巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质

26、一级结构的测定,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,测定步骤,4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； 如:离子交换层析法 一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸型的离子交换树脂，这是一种高分子量的固体聚苯乙烯，带有大量的功能基团，磺酸基在低pH和低离子强度条件下，根据氨基酸的酸碱性，氨基酸带正电，于是替换下树脂上的Na+，借助静电作用而结合到磺酸基上。,蛋白质一级结构的测定,5.分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分

27、析法,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,测定步骤,6. 多肽链部分裂解成肽段。 酶解法: 胰蛋白酶 糜蛋白酶 胃蛋白酶 嗜热菌蛋白酶 羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,测定步骤, 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,7. 测定各个肽段的氨基酸顺序,8. 确定肽段在多肽链中的顺序。,测定步骤,9.确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， 然后同其它方法分析的肽

28、段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,例题 下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中： CNBr , 异硫氰酸苯酯 , 丹黄酰氯 , 脲, 6mol/LHCl 巯基乙醇, 水合茚三酮, 过甲酸, 胰蛋白酶, 胰凝乳蛋白酶 .其中哪一个最适合完成以下各项任务？（a）测定小肽的氨基酸序列。（b）鉴定肽的氨基末端残基。（c）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？（d）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。（e）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。（f）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。,二. 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能,蛋白质一级结构举例：核糖核酸酶（RNase）分子量：1

29、2600,124个a.a残基4个链内二硫键。牛胰Rnase变性-复性实验：(8M尿素+硫基乙醇)变性、失活透析，透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。,三. 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化,同源蛋白质：来源不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白 细胞色素同源蛋白质的特点：多肽链长度相同或相近同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺

30、序差异就越大。,细胞色素C,存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。,细胞色素c的一级结构与生物进化的关系,四. 蛋白质一级结构的个体差异分子病,分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。 镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，以血红蛋白为例：22寡聚蛋白正常人

31、血红蛋白，.N.Glu 6镰刀型贫血.N.Val 6生理条件下电荷：Va10Glu-疏水 亲水因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血.,1、一级结构中的保守序列决定空间结构 （1）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能 （2）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构 【经典举例】酶原激活、分子病、蛋白变性与复性 （3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变 【经典举例】分子病,一、一级结构与功能的关系,2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素 分子伴娘(molec

32、ular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。 与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成； 引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构； 可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。,二、 蛋白质的三维结构,蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 主要有-螺旋、-折叠、-转角、 无规卷曲。,1蛋白质的二级结构,（1）-螺旋,在-螺旋中肽平面的键长和键角一定； 肽键的原子排列呈反式构型； 相邻

33、的肽平面构成两面角；,1）-螺旋特点, 二面角：= -57, = - 48，是一种右手螺旋 每圈螺旋：3.6个a.a残基，高度：0.54nm 每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm 氨基酸残基侧链向外 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=O氧间形成氢键。,2）影响-螺旋形成的主要因素, 存在侧链基团较大的氨基酸残基； 连续存在带相同电荷的氨基酸残基； 存在脯氨酸残基。 pH对螺旋的影响多聚L-Glu和多聚L-Lys 这种典型的螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。

34、如310 4.416,3）右手-螺旋与左手-螺旋右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（+64、+42）。,4）、 -螺旋结构的旋光性由于-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：a:碳原子的不对称性, b: 构象本身的不对称性。-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。 5）、 -螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性一旦形成一圈-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速,（2）-折叠,（2）-折叠,-折叠的结

35、构特点,1）-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象 2）在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm； 3）-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。,4）-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。 5） 类型 氢键连接 纤维状蛋白质 反平行式 不同肽链间 球状蛋白质 两种都有 不同肽链间 不同分子

36、 同一肽链的不同肽段,大家现在做一下P249第二题,（3）-转角,-转角（ U形转折,发夹结构）：是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为： 1） 主链骨架本身以大约180回折; 2） 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 3）构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。 4) 一些R侧链较小氨基酸如Pro Gly Asp Asn Cys Ser经常出现在-转角中； II型-转角中的第三个氨基酸残基总是Gly,5) 主要有两种类型：I 型和II型；二者主要差别是中央肽基旋转了1800， 为什么转角大多数位于蛋白质的表面,而不是在蛋白质的疏水核心?,2 超二级

37、结构 （1）.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（-螺旋或-折叠或-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。,（4）自由回转 没有一定规律的松散肽链结构，约占球蛋白分子结构的一半；蛋白质（酶）的功能部位常常位于这种构象之中。,（2）.超二级结构的基本类型：、 、,（3）纤维状蛋白质 外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于1()(小于10的为球状蛋白质),纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性两类， 1.前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等； 2.后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌动蛋白细丝(actin filamen

38、t)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。,1）毛发的结构P213,一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。 毛发性能就决定于螺旋结构以及这样的组织方式。,2）卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。 这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，此外角蛋白中的螺旋多肽链

39、间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,3）-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。,丝蛋白的结构,丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为： -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-,3、蛋白质的三级结构,（1）.蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指

40、多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。 基本类型：全结构、 ,结构、全结构、富含金属或二硫键结构域。,胰岛素分子的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,（2）蛋白质的结构域(domain), 较大的蛋白质分子或亚基中，在超二级结构基础上组装而成三级结构的局部折叠区，在空间上可以明显区分的球状区域，是球状蛋白的独立折叠单位，是构成三级结构的结构单元。结构域通常也是功能域。,（3）.维持三级结构的作用力,1）.氢键 2）.范德华力 3）.疏水键（疏水相互作用）在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏

41、水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用。 4）.离子键（盐键） 5）.二硫键 疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。,次级键介导蛋白质高级结构形成,肌红蛋白三级结构的重要特征是：l）肌红蛋白分子结构极为紧密，呈扁平棱形，一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。大小为4.5l nm *3.5nm*2.5nm, 内部很少空隙,（4）.肌红蛋白的结构与功能,肌红蛋白的构象,2 ）约有75-80 的主链折叠成-螺旋构象。全部为右手螺旋,共有8 段长短不一的螺旋区，各分为A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H , 不对称

42、地盘曲成层;其余一部分是五个无规卷曲，AB 、CD 、EF 、FG 、GH ,多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成;,N 一末端和C 一末端也是无规卷曲，前者两个残基命名为NA1 、NA2 ， 后者五个残 基命名为HC1 一HC5.,3 ）内侧和外侧分明。 分子内部是疏水的空穴，几乎所有疏水侧链都位于空穴周围，绝大多数亲水侧链分布在分子表面，在分子内侧只有两个组氨酸残基（E7 、F8) ，并在活性部位起重要作用。在分子外侧，极性和非极性残基都有。,4)血红素位于空穴中 ，血红素中的Fe2有6 个配位键，其中两个与血红素分子平面垂直，并分别与肌红蛋白F8 的HIS 残基的咪唑环上的N 及O结

43、合。肌红蛋白分子中的疏水区可防止Fe2被氧化，保证了Fe2与o的可逆结合。,血红素（铁卟啉 ）辅基的结构及其氧合部位,5）煤气中毒的机制,一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红素的结合能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。,6）肌红蛋白的氧合曲线(P256)MbO2 Mb + O2 k=,Y=,Mbo2,Mbo2+Mb,(Y代表在给定的氧压下 肌红蛋白的氧饱和度),Y=,PO2,K+PO2,（1）

44、,（2）,由（1）可见：Y=1时， 表明所有肌红蛋白的 氧合位置均被占据 由（2）可见： Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，P(O2)=K 解离常数为肌红蛋白一半被饱和时的氧压。,Mbo2,Mb o2,Hill曲线：,Hill系数,Hill系数=1.0蛋白质或只含一个结合位点，或含有多个结合位点，而这些结合位点彼此完全独立并有相同的K值。 Hill系数不等于1.0，表明蛋白质含有多个结合位点，而这些结合位点彼此有相互作用。,4、蛋白质的四级结构,是指由两 个或两个以上具有三级结构的亚基按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。,1）定义,亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，

45、具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。 亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力 亚基可以相同或不同,2.维持蛋白质四级结构的主要作用力,1)在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。 2)亚基之间通过次级键彼此缔合在一起（二硫键？） 3)疏水键是最主要的作用力。,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,血红蛋白的结构与功能,（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH.,1、空间结构体现生物特异

46、性 2、空间结构体现生物活性 3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性,3、空间结构与功能的关系,（2）血红蛋白的结构特点：,a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000 b.成人的血红蛋白为22（HbA-96%）、22（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为22（HbF） c. 链由141AA残基组成， 链由146AA残基组成。,（3）氧合引起血红蛋白的构象变化,别构蛋白,：蛋白质分子中不止有一个配基的结 合部位（活性部位），还有别的配基 的结合部位（别构部位）。别构蛋白 都有别构效应。,A. 几个概念,别构效应,：蛋白质与配基结合后改变蛋白质的 构象，进而改变蛋白质的生

47、物活性 的现象。,别构蛋白的结构特点,. 都是寡聚蛋白质，有四级结构. . 分子中每个亚基上都有活性部位，或者还有别 构部位；某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。 . 不同亚基各部位之间存在相互作用，部位之间的影响是通过构象变化传递的.,协同效应：指第一亚基与其配体结合后,可以影 响此寡聚蛋白中另外亚基与配体的结 合能力.,协同效应,正协同效应,负协同效应,S形曲线,类似双曲线,（血红蛋白）,B.氧合引起的血红蛋白的构象变化,非氧合蛋白中四个亚基间的相互作用,与氧结合时血红蛋白的变构过程,血红素中铁原子的变化 高自旋状态 低自旋 （非氧合，原子半径较大） （氧合，原子半径较小）,与氧

48、结合时血红蛋白的变构过程,亚基三级结构及整个蛋白四级结构的变化,C. 血红蛋白的氧合曲线,血红蛋白的氧饱和度（Y）定义为： Y=,血红蛋白中被占的氧合部位,血红蛋白中氧合部位总数,Y=,O2n,K+02n,20 40 60 80 100 Po2(torr),1.0,0.5,氧 饱和度（Y）,（Hill经验 公式）,Y=,Pno2,K+Pno2,血红蛋白S形氧合曲线的生理意义,S形氧合曲线反应了血红蛋白对 于O2的结合与解离，存在协同作用。使血红蛋白更有效地担负输送氧的任务。,D. H+、CO2和BPG 对血红蛋白结合氧的影响,氧亲和力：指血红蛋白对于氧的结合牢固程度(P50 )。,H+、CO2

49、的影响,1914年，C.Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2。血红蛋白对O2、 H+和CO2结合的这种相互关系叫波耳效应,波耳效应的生理意义,H+、CO2对血红蛋白氧合能力影响的解释,H+的结合部位,146-His N-Val 122-His,使血红蛋白保持T态,CO2的结合部位,四个亚基N-末端氨基,Hb-NH2 + CO2,Hb-NH-COO- + H+ 氨甲酰衍生物,CO2 + H2O,H2CO3,HCO3 + H+,-,（氧合态）,BPG的影响：,HbO2Hb(O2)2Hb(O2)3 Hb-BPG Hb(O2

50、)4+ BPG BPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义： BPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的BPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 BPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。 实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液。,1.0 0.5,Po2,Y,有BPG,E.胎儿血红蛋白的氧合能力大于HbA,胎儿血红蛋白（HbF）为22，而成人血红蛋白(HbA)为22， 与的区别为： 143His (BPG与亚基的结合部位： Val1-NH3+ Lys82-NH3+ His143-咪唑基) 14

51、3Ser，使HbF与BPG的结合能力减弱，因而增加了HbF对氧的亲和力。其意义在于胎儿血液流经 胎盘时HbF可以从母体HbA获得O2。,4、空间构象并非生物活性的唯一影响因素 【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。 5、蛋白构象疾病：错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。 老年痴呆 疯牛病 亨汀顿舞蹈病,有A,B两种多肽,具有相似的三结构,但A通常以单体的形式存在,B以四聚体B4的形式存在.你认为A和B的氨基酸组成会有什么差别? 为什么镰状细胞贫血病的患者要尽可能避免剧烈的运动和去海拔高的地区?,第七节 蛋白质的性质,蛋白质与多

52、肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,1 蛋白质的两性离解和电泳现象,(1)布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力 (2) 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。 两性电解质非等电状态时，带同

53、种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。,2 蛋白质的胶体性质,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法,3 蛋白质的沉淀作用,(1)可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀 强酸碱沉淀 重金属盐沉淀 生物碱沉淀,3 蛋

54、白质的沉淀作用,(2)不可逆沉淀,盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀有机溶剂沉淀法破坏水化膜，降低介电常数蛋白质分子中相反电荷基团的引力增大，互相吸引凝集，从而使其溶解度降低。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要原因与盐析相似，和蛋白质争夺水膜，使蛋白质聚集并沉淀析出。,(3)沉淀蛋白质的方法,重金属盐沉淀pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是

55、指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 加热变性沉淀。往往是不可逆的。,(1)变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其它理化常数改变(denaturation)。,4 蛋白质的变性,(2）变性的因素： )强酸和强碱； )有机溶剂，破坏疏水作用； ) 去污剂、去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用； ) 还原性试剂：尿素、b-硫基乙醇； ) 重金属离子，Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。 ) 温度； ) 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。,（3）变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一

56、级结构的破坏。 （三个改变一个不变） （4）蛋白质变性后，往往出现下列现象：结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。硫水侧链基团外露。理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。生理化学性质改变。分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。 蛋白质紫外吸收增加,5 蛋白质的颜色反应,OH,N,第八节 蛋白质的分离与提纯,一、制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下： 1.以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。 2.以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。 3.以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交

57、换层析等。 4.以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。,二、蛋白质纯化的一般设计原则,1、样品的选择（来源方便、成本低、易操作的组织或细胞）组织或细胞的破碎方法采匀浆、电动捣碎、超声波破碎法。 2、建立一个特异、快速、精确、可重复的检测方法。 3、分级分离，先粗后细。利用简单、易处理并快速的方法粗分，例如硫酸铵沉淀、分级离心等除去大部分杂蛋白。利用离子交换层析、分子筛层析、电泳等进一步纯化。 4、避免蛋白质的变性。（pH中性、适当温度和接近生理状态的缓冲体系等）,1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatograp

58、hy)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。,一、层析技术,一、层析技术,1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理,1、层析技术原理,层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。,2、层析技术分类,3、常用的层析原理,（1）分配层析纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）, =,?,13.5,1/8,15/8,90/8,270/8,351/8,81/8,1/24,18/24,135/24,540/24,1161/24,243/24,?,纸层析,纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水