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文档简介
1、实验三从琼脂糖凝胶中回收并纯化dna片段生工 1201 班 1汪文斌一、实验目的学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化dna片段的方法二、实验原理将 dna样品在琼脂糖凝胶电泳后， 在紫外灯下切割下含目的 dna片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，dna就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用 te缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的 dna洗脱下来。回收纯化后的dna可直接用于 dna的连接反应、标记反应、测序反应或 dna的微量注射等研究。三、实验材
2、料水浴锅、离心机、移液器pcr扩增的 rv1791基因takara minibest agarose gel dna extraction kit ver.4.0四、实验步骤（ 1）实验三中的 pcr产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳。（ 2）在紫外灯下切出含有目的 dna的琼脂糖凝胶， 用纸巾吸尽凝胶表面的液体。尽量切除不含目的 dna部分的凝胶， 尽量减小凝胶体积， 提高 dna回收率。切胶时不要将 dna长时间暴露于紫外灯下，以防止 dna损伤。（ 3）切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤 6 的胶块融化时间，提高 dna的回收率。（ 4）称量胶块重量， 计算胶块体积。 计算胶块体积时， 以 1
3、mg=1 l 进行计算。（ 5）向胶块中加入 3 倍凝胶体积的胶块融化液 dr-i buffer 。（ 6）均匀混合后 75加热融化胶块， 此时应间断振荡混合， 使胶块充分融化（约610min）。（ 7）向上述胶块融化液中加入dr-i buffer量的 1/2 体积量的 dr-ii buffer，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 dna片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。1（ 8）离心柱放入收集管中， 将步骤 7 的溶液转移至离心柱中， 12,000 rpm，1min，弃滤液。 如将滤液再加入离心柱中离心一次，可以提高 dna的回收率。（ 9）将 500 l 的 rinse a 加入离心柱中， 12,000 rpm ， 30s，弃滤液。（ 10）将 700 l 的 rinse b 加入离心柱中， 12,000 rpm ，30s，弃滤液。（ 11）重复操作步骤 10，将离心柱放入收集管中， 12,000 rpm ，1min。（ 12）将离心柱放入新的指形管中， 在离心柱膜的中央处加入 25l 的灭菌蒸馏水或 elution buffer ，室温静置 1min。 注）把灭菌蒸馏水或 elution buffer 加热至 60使用时有利于提高洗脱效率。（ 13）12,000 rpm ，1min，洗脱 dna。五、实验结果与
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