共焦显微镜下真菌菌丝形态的观察分析

1、共焦显微镜下真菌菌丝形态的观察分析作者：杨洁 牛际铭杜敏刘钰邵玲闫淑来源：中国医学创新2015年第36期【摘要】 目的：通过对共焦激光显微镜下不同真菌菌丝形态分析总结，为真菌性角膜炎临床诊断治疗提供指导，并为进一步共焦激光显微镜下菌属菌种鉴定研究提供参考。方法：回顾性分析本院2014年8月-2015年10月在共焦激光显微镜下查到菌丝的75例真菌性角膜炎患者的临床资料，对比观察共焦显微镜下不同时期和不同患者的各种菌丝形态，总结其特点。结果：不同真菌性角膜炎患者在共焦显微镜下菌丝形态表现多样，感染早期菌丝数量少，不易查到，需要仔细观察。活动期菌丝量较多，排列密集，不同菌种形态不同，有呈水平分布，长

2、线状、竹节样高反光，有节段或分支，有呈簇状垂直或斜行分布，分支较多、较细；菌丝旁也可见小点状、圆珠状、短棒状等真菌孢子样形态，呈高反光，也有呈低反光表现，共48例48眼。使用过抗真菌药物的部分病例可见断裂的菌丝节段、肿胀菌丝，有的菌丝变得僵直，有的形态奇特，粗细不一。抗真菌药物治疗后复查的2例显示菌丝减少或仅存少量节段，3例已查不到菌丝，病灶区上皮层完全修复，基质层纤维化瘢痕形成，呈高反光。结论：共焦激光显微镜检查是早期诊断真菌性角膜炎的一项有效手段，并能判断病情转归及指导药物治疗。【关键词】 共焦显微镜； 菌丝； 真菌性角膜炎Observation and Analysis of Funga

3、l Hyphae Form under Confocal Microscope/YANG Jie，NIU Ji-ming，DU Min，et al./Medical Innovation of China，2015，12（36）：044-047【Abstract】 Objective：To summarize the different morphological features of fungal hyphae under confocal laser microscopy in order to provide guidance for clinical diagnosis and tr

4、eatment of fungal keratitis and provide reference for further application of confocal laser microscope on the strains of fungi species identification.Method：The clinical data of 75 patients who were confirmed with fungal infection by confocal microscopy in our hospital from August 2014 to October 20

5、15 were retrospectively analyzed.The fungal hyphal morphology at different infection periods and different patients under confocal laser microscope were observed and analyzed，their characteristics were summarized.Result：In the early stage of infection，the hyphae amount was less，it was not easy to be

6、 found，which requiring careful observation.In the active stage of infection，the hyphal quantity was more and intensive，the forms were different in different strains.Some hyphae were with a horizontal distribution，long line，bamboo sample with high reflective，hyphal segments or branch.Some hyphae show

7、ed like clusters with vertical or diagonal line distribution，more branchs and finer.Near the hyphae，small dot，round bead shape and short rod shape fungal spores were visible，which showed highly reflective or low reflective，there were 48 eyes of 48 cases in this stage.some cases who once used antifun

8、gal drugs before the first time confocal laser microscopy examination showed fracture segment，swelling hyphae，some hyphae became rigid，some cases manifested strange shape and different thickness.After effective antifungal drug treatment，2 cases of the re-examination patients showed that the density

9、of hypha were reduced or only remaining a small number of segments，3 cases of the re-examination patients were with no hyphae.Epithelium in the lesion area was completely repaired，fibrous scar formed in the stromal layer with high reflection.Conclusion：Confocal laser microscopy is an effective metho

10、d of early diagnosis of fungal keratitis.It can evaluate the outcome and direct the treatment of antifungal medication.【Key words】 Confocal microscopy； Hypha； Fungal keratitisFirst-authors address： The Second Peoples Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou ，Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.015

11、真菌性角膜炎是真菌直接感染角膜引起的一种严重的致盲性角膜病，是感染性角膜病致盲的首位原因1。该病若控制不及时，极易造成角膜穿孔、前房积脓、眼内炎等严重后果，因此对本病的早期诊断和治疗尤为重要。角膜共焦激光显微镜是一种快速、有效、无创伤、可重复进行的活体检查方法，能动态观察真菌感染在不同时相角膜组织中的菌丝和孢子的情况，并能动态观察治疗效果，敏感性和安全性高，越来越得到临床广泛的认可。但是，应用共焦显微镜诊断真菌性角膜炎尚依赖检查者的技术经验，目前，可供参考的真菌菌丝共焦图片有限，本研究通过对75例在共焦显微镜下明确查到菌丝的真菌性角膜炎患者的菌丝形态进行仔细观察分析后，发现真菌菌丝的形态各异，

12、患病初期、活动期，用药后，以及不同菌种形态表现也不同，现将其特征总结如下。1 资料与方法1.1 一般资料 选择2014年8月-2015年10月就诊于本院的真菌性角膜炎患者75例（75只眼）作为研究对象，入选患者均在共焦显微镜下明确观察到菌丝，其中男39例（39只眼），女36例（36只眼）；年龄2075岁。其中17例在检查前行药物抗真菌治疗，其余58例检查前未行抗真菌治疗。1.2 方法 5例患者在共焦激光显微镜下查出菌丝后行抗真菌治疗，分别于用药后半个月、1个月及2个月后复查，所有患者均在裂隙灯显微镜下观察后并拍照，再行角膜共焦激光显微镜检查，具体方法如下。1.2.1 裂隙灯显微镜检查及照相 使

13、用拓普康SL-D7型号的裂隙灯显微镜，以直接焦点照明法检查，宽光照射采集角膜上皮病变，窄光照射采集角膜病变层次，后部反光照射法采集角膜内皮情况。1.2.2 共焦激光显微镜检查 仪器：共焦激光显微镜是由海德堡视网膜激光断层扫描系统3代（HRT3）和Rostock角膜模块组件（RCM）组成。主要参数：激光光源波长670 nm，放大倍率800，数字分辨率：横向1m/像素，纵向2 m/像素。横向视野：400 m400 m。检查方法：患眼滴用盐酸丙美卡因滴眼液（爱尔凯因）表面麻醉后，将卡波姆眼用凝胶滴于物镜头表面，盖上无菌角膜接触帽。调整操纵台高度和CCD摄像头位置，使CCD摄像头的光轴与激光扫描摄像头

14、的光轴垂直。打开软件，调整焦平面，当图像窗口显示为全白时，将焦平面设置为0。患者下颌和前额分别固定于下颌托和前额托上，根据病灶位置调整固视灯位置，并嘱患者注视前方的固视灯。将激光扫描摄像头缓慢前移，直到角膜接触帽轻微接触患者角膜病灶。当显示器上出现角膜图像时，微调焦距，连续扫描角膜各层结构，重点连续扫描病灶区及病灶周边部位，仔细观察角膜各层结构情况并采集有意义图像。2 结果共焦激光显微镜下观察角膜溃疡及周边的改变，显示角膜病灶区组织破坏，各层结构紊乱，溃疡区及其周围各层可见不同程度的炎性细胞浸润，基质层水肿态，严重者深层基质及内皮窥不入，菌丝根据病变程度不同分布深度不同，从上皮层、浅基质层到深

15、基质层、甚至内皮层可见到菌丝；菌丝形态各异，根据病变不同时期和治疗阶段以及不同种的菌丝形态特征不同，回顾性分析不同患者的菌丝特点，选择典型病例总结如下。2.1 感染早期 患者角膜外伤史03 d，主要是植物外伤，该组病例有5例。共焦激光显微镜检查显示病灶区内及边缘表层及浅基质层可见少量丝状物，部分见分枝，呈高反光，较细。2.2 活动期 可见大量菌丝，排列密集，纵横交错，可见节段、分支，呈串珠样（图1A）、竹节样（图1C）或树枝样（图1E），有的呈水平排列（图1A、1B、1C），菌丝较粗，分支少；有的呈簇状垂直或斜行排列（图1D、1F），菌丝较细；菌丝大部分呈高反光，部分呈小虫状低反光（图1E），

16、夹杂圆点状低反光，有时为高反光，共48例48眼。图1 活动期2.3 使用过抗真菌药物 17例患者在检查前进行过抗真菌药物治疗2 d1周不等，共焦激光显微镜下不同患者表现不同，部分病例在浅层可见断裂的菌丝节段，呈高反光，有的可见肿胀的菌丝，有的菌丝变得僵直，还有的菌丝形态奇特，粗细不一。2.4 抗真菌药物治疗后复查 5例复查患者共焦激光显微镜下显示3例已查不到菌丝，2例菌丝减少或仅存少量节段，病灶区瘢痕化，上皮层修复完全，基质层纤维化，反光增强。角膜病灶较前局限，边界变清，浸润灶变薄，透明度增加，角膜水肿明显减轻甚至消失。2.5 不同孢子形态 部分病例菌丝旁可见较多梭形高反光（图2A），有些病例

17、菌丝呈簇状，垂直排列，其顶端可见小点状高反光（图2B），有时呈圆珠状低反光（图2C），个别病例菌丝旁可见短棒样高反光，规则排列于菌丝两侧（图2D）。3 讨论真菌性角膜炎是感染性角膜病致盲的首位原因，本病一般有明显的致病危险因素1。有文章报道，不同菌属的感染危险因素也有不同，镰刀菌属和链格孢霉属以植物性外伤史为主，其次为迷眼史；曲霉菌属多由迷眼史引起，其次为植物和铁质异物外伤史2。因此，角膜溃疡患者的病史至关重要，应详细询问。真菌性角膜炎危害严重的一个主要原因就是缺乏正确的早期诊断，从而导致误诊并延误治疗。真菌性角膜炎的早期诊断技术有多种3。KOH湿片法简单、快速、经济，但受取材部位影响较大、漏

18、诊率高。Gram染色法和Giemsa染色法为经典染色法，但在菌丝量少时检出率不高、敏感性差。PAS染色法虽然特异性高，但染色时间较长、操作复杂、所需试剂多且结果需要有专业经验判断，不能观察组织细胞等细微形态变化。荧光染色法简单、快捷、敏感性和特异性高，但须配备一台荧光显微镜，且紫外荧光对人体的危害等限制了其临床应用。PCR技术是一种新型技术，有诸多的优点，但是对实验条件要求较高，否则容易污染，出现假阳性率引起误诊，且不能鉴别菌株。共焦激光显微镜具有无创、可重复性强、快速、有效等优点，自1989年Cavanagh等4首次将其应用于活体人眼的观察，在过去的26年间，越来越得到眼科医生的青睐，甚至有

19、些医生把它称为眼表医生的第三只眼。共焦激光显微镜可以从细胞水平对眼表的各个组织进行病理生理的直接观察，如眼睑、结膜、角膜、角巩膜缘等，其中对感染性角膜炎的鉴别诊断应用最多，特别是真菌性角膜炎和棘阿米巴性角膜炎的诊断具有独特的优势5-13。有文献12报道共焦激光显微镜对真菌的检出率较高，可高达96%以上。引发角膜感染的真菌约有70余种14。在我国导致真菌性角膜炎的首要致病菌是镰刀菌属，其次是曲霉菌属15-16。不同菌属的真菌感染角膜后引起的临床特征及组织病理学不尽相同2，17。由于真菌性角膜炎主要由镰刀菌、曲霉菌等丝状菌和能产生假菌丝的念珠菌所引起，所以，一般认为，共焦激光显微镜对真菌性角膜炎的

20、诊断以观察到菌丝为依据，也能观察到孢子，且观察到的菌丝和孢子与角膜刮片标本显微镜下所见相似11-12。同一菌属不同菌种感染所致的真菌性角膜炎的共焦显微镜影响表现较为一致18。研究显示，镰刀菌属的菌丝在角膜内主要呈水平生长，曲霉菌属和念珠菌属的菌丝在角膜内主要呈垂直生长1。这是根据角膜病理切片时，菌丝在角膜内的生长方向与角膜基质板层纤维的夹角来判定的，大于45者判定为垂直生长，小于45者判定为水平生长。本研究入选的75例患者中均在共焦显微镜下明确观察到菌丝，部分在菌丝旁还看到一些孢子样结构反光。菌丝在各个发病阶段菌丝量不同，这与其他报道一致19。本研究发现角膜植物性外伤03 d的早期感染，病灶面

21、积小，有时甚至只有上皮的损伤，此时如果行刮片，将加重角膜损伤，共焦显微镜如果能在超早期就识别出真菌菌丝，将使患者避免很多痛苦，但菌丝量较少，需要仔细查找并辨认；活动期的菌丝数量较大，且不同种菌丝形态不同，有的菌丝呈水平生长，为直线或斜行交叉分布，长而直挺，分支少，粗细均匀的线状高反光，与报道的镰刀菌属菌丝形态相似20。同时有些菌丝旁可见近梭形的高反光，与刮片染色显微镜下茄病镰刀菌的孢子相似11；而有些菌丝在浅层呈簇状垂直或斜行排列，较细，分支较多，菌丝大部分呈高反光，部分呈低反光，小虫状，与报道的曲霉菌属菌丝形态相似，菌丝顶端或其间夹杂大量小点状高反光，有时为圆珠状低反光，与刮片染色显微镜下烟

22、曲霉菌的孢子结构相似，另外本研究还在菌丝两侧见到规则排列的短棒样结构高反光，应该是孢子，但具体是哪种真菌，尚需鉴定。未使用过抗真菌药的菌丝一般形态比较典型，但使用过抗真菌药物的患者检查共焦时，菌丝形态有时会不太典型，但也能看出一些特点，部分在浅层可见断裂的菌丝节段，呈高反光，有的可见肿胀的菌丝，有的菌丝变得僵直，还有的菌丝形态奇特，粗细不一。当有效的抗真菌药物治疗后复查时，共焦下菌丝量减少、仅存少量节段或菌丝消失、上皮层修复完全、基质层纤维化瘢痕形成，反光增强，这与其他报道一致20。因此共焦检查可以用于指导药物治疗。另外，菌丝和神经纤维需鉴别，笔者认为鉴别点在于菌丝的丝状物立体感强，有节段或分

23、支，而上皮下神经纤维有平面感，基质层神经纤维虽然较粗，但这两种神经纤维分布处均为正常组织，菌丝分布处一般没有正常组织，如果溃疡区苔被太厚，可在溃疡边缘查找菌丝，有时只看到一些稍露头的短线状菌丝形成毛糙的边缘。综上所述，本研究对75例在共焦下明确查到菌丝的真菌性角膜炎患者的资料进行仔细分析，特别是对各种菌丝形态特点进行总结，提供了大量共焦图片，丰富了目前有限的菌丝形态参考数据，为眼表临床医生及共焦检查技术人员提供帮助，并为以后对菌属菌种鉴定提供参考资料。参考文献1谢立信.临床角膜病学M.北京：人民卫生出版社，2014：41-48.2王秀先.三种常见菌属真菌性角膜炎的临床特征及相关特点分析D.济南

24、：济南大学山东省医学科学院，2012.3张伟宏，王丽娅，韩雷，等.真菌性角膜炎的早期诊断技术J.医学与哲学（临床决策论坛版），2009，30（6）：65-67.4 Cavanagh H D，Petroll W M，Alizadeh H，et al.Clinical and diagnostic use of in vivo confocal microscopy in patients with corneal diseaseJ.Ophthalmology，1993，100（10）：1444-1454.5胡蓉蓉.共焦显微镜检查在眼表系统中的应用J.眼科研究，2007，25（11）：893-896.6魏安基.活体共焦显微镜下正常人睑结膜及睑板腺的年龄变化及性别差异D.上海：复旦大学，2010.7黎明，林跃生，姚晓明，等.人体角膜内皮细胞的共焦显微镜研究J.中国实用眼科杂志，2007，25（5）：479-482.8罗丽辉，刘祖国，陈家祺，等.正常角膜基质细胞密度和角膜厚度的研究J.眼科研究，2004，22（5）：512-515.9严冬，张宝莹，刘宏伟，等.青光眼滤过术后的形态观察J.中国现代药物应用，2011，5（20）：14-15.10张军，王丽娅，孙声桃，等.感染性角膜炎