实验室做细胞常用染色

1、实验室做细胞常用得细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养得细胞 ,在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间得染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附得物质就是经常采用得方法之一. 能促进细胞黏附得物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸得涂布方法.1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如 Dco)浸泡min，间或振荡。2、用自来水冲洗 5mi。3、以 1盐酸 70乙醇溶液浸泡5mi 4、烤箱干燥 (至此即可用于普通染色 )。5、多聚 L- 赖氨酸 (1:10 溶于去离子水 ）浸泡 5in,振荡。6、入 60烤箱 1

2、,或室温过夜干燥 (用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学 ).二、细胞固定常用方法固定细胞得目得在于把组织与细胞得原有结构尽可能完整地保存下来,避免组织与细胞发生降解、自溶、腐败与变形等,使细胞与组织内得各种酶失去活性，防止细胞与组织得各种分子变性、解离,使细胞得化学物质与酶能准确定位，并在以后得处理与制片过程中亦不发生改变与破坏。同时，固定还可使细胞得各部分易于着色 ,适于观察、长期保存与分析.1、固定组织、细胞得基本原则：尽可能选用新鲜培养物;根据检测工具、对象、目得与要求选择固定剂与固定方法。2、培养物得准备与固定前处理:各种细胞培养物 ,如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养

3、物与盖片单层培养物都可作固定材料.对双盖片悬滴培养物与悬液培养物来说 ,常通过离心收集细胞， PBS 漂洗 23 次后 ,备固定制片；对盖片单层培养物来说 ,将盖片从培养器皿中取出后，PBS 液漂洗 2次 ,以洗去血清与附着于细胞表面得残渣,备固定用 .3、常用固定液 :常用得固定液分两类，一类就是以单一化学物质配成得固定液 ,称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸） 另一类就是用两种或两种以上化学物质配合成得固定液，称混合固定液。如Mu ler 固定液、Fl i g 固液、 FAA 固定液、 Carno固定液、 os

4、an 固定液、 A ann固定液、 Bouing 固定液等。不同得固定液对细胞得化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此,选择合适得固定液就是达到固定目得得基础。( )4%甲醛 PS:甲醛就是一种气体，其饱与水溶液无色,约含 4 %甲醛 .在很多情况下 ,甲醛常常产生多聚甲醛得白色沉淀。4甲醛 PBS 使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织得外部形式,固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精与其她合成染料染色。甲醛得穿透力较强，对组织固定均匀,能增强组织得弹性，大标本得固定与保存多用甲醛。甲醛就是染色体、线粒体与高尔基体得固定液 ,在冷冻切片中 ,甲醛作固定剂具有显著得优点.用 40%甲

5、醛水溶液 :PBS=:9 配方制备甲醛固定液。（2）丙酮 :丙酮为无色易挥发液体 ,用纯冷丙酮 ()固定细胞内酶效果较佳 .(3)乙醇 :乙醇又称酒精 ,固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌与白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇与醋酸得混合液就是固定肝糖原及肌糖原得良好固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化与脱水得作用.作为固定用乙醇得适宜浓度为 0%1 %。乙醇得缺点就是渗透力差,并使组织收缩 .（）醋酸 :常用 0、% 浓度得醋酸作固定剂 .醋酸能与水及乙醇、甲醇溶合 ,醋酸不固定蛋白质 ,但能固定核酸。醋酸得穿透力很大，它对细胞得膨胀作用显著 ,这就是由于它破坏了某些蛋白质分子得结合,所以

6、,常用醋酸来减少其她固定剂引起得细胞收缩。细胞学技术中 ,它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体 ,还能把染色质沉淀成为可染色得块状体.(）苦味酸 :苦味酸就是黄色结晶体，强酸,可溶于水、乙醇、苯与二甲苯,在水中得溶解度可因水温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白与核酸。苦味酸得穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。它与其她药物混合配制时,可以作为蛋白质得沉淀剂,同时可避免组织收缩、硬化 ,而且易于染色 .所以在很多混合固定液中被广泛采用。作固定用得最适浓度为1%.(6)锇酸 (四氧化锇 ）:锇酸就是一种强氧化剂,不能同乙醇与甲醛混合使用。它得挥发性很强 ,挥发出来得气

7、体能固定结膜,对眼睛很有害，所以操作时应特别注意。四氧化锇就是保存细胞结构得最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入10m、 mol L 磷酸缓冲液 (pH7、07、 4),再将装有 1g锇酸得安培瓶放人PBS 中,以玻棒击碎安培瓶 ,摇荡使锇酸溶解，备用。常用得固定液浓度为 1% 2%。( )戊二醛：戊二醛对组织得渗透率高,与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管与膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原。常用得戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表 121 常用得戊二醛固定液配制方法Ph、 2 得 0、1mo /L 磷酸缓冲液69298(ml)9625%戊二醛水溶液 ( l)81012

8、戊二醛得终浓度 1%1、 52%2、3%(8）甲醇醋酸固定液：甲醇:醋酸为 3：1 得固定液就是应用最广得一种培养细胞固定剂。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变 .不仅最适用于固定染色体,而且固定得染色体适于Gie a 染色 (注意 :此固定液宜现用现配 )。（ )FAA 固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养得细胞,固定效果好 .配制方法 :90ml 80%酒精中加 5ml 冰乙酸与 5 40%甲醛。(10)ar oy 固定液 :Car y 固定液就是较好得非水溶性固定液，就是显示细胞化学成分 (如粘多糖等 )时常用得固定剂 ,固定、保真效果好 ,但穿透力差，适

9、于固定培养得单层细胞.配制方法： 60ml 纯酒精加 30氯仿与0ml 冰乙酸(） ouin 固定液 :用于固定双盖片法培养得标本，固定30 分钟后，用70酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色,可将标本保存在 酒精中。本试剂适于固定组织细胞得糖原。配制方法:先将 75m饱与苦味酸 （100 l 水中加、 2、 4)过滤 ,加入 25ml 福尔马林 (0甲醛 ,有沉淀时禁用 ),最后加入 5 l 冰醋酸 ,混与后存于 冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组织细胞穿透力较强 ,固定效果较好 ,保存得细胞结构完好 .但因偏酸 (p为 33、5),对抗原有一定损害。(12）4多聚甲醛 -PBS

10、固定液 :多聚甲醛为白色固体 ,在0ml 蒸馏水中加入4多聚甲醛 ,加热至 70时 ,边搅拌边逐滴加入2 l ,至液体清晰透明用 m /LHC 调节 H 至 7、，冷却后加入 0、01l/LPBS 液至 10ml,4保存。本试剂适于固定肾纤维蛋白与细胞骨架蛋白。三、常见得细胞染色方法普通染色观察苏木精 -伊红 (hematoxyline in,H)染色与 Gimsa 染色就是观察培养细胞一般形态得最常用方法, 也就是把细胞作为标本保存得主要方法对于贴壁培养得细胞，以生长于盖玻片与塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Ha液、 PBS、 SS或生理盐水清洗培养物2 次,去除妨碍染色得血清。固定后可将

11、盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀 (10rin，1mi ), 弃上清液后 （留少量液体 ), 将细胞悬液滴于玻片上做成涂片, 冷风吹干。1、 H染色法1、1、1 染液配制（）苏木精染液 :这里介绍鄂征 (995）改良得 Maer 法。称取 、 5g苏木精 ,5、 0g铵矾或钾矾 ,0、1碘酸钠加温溶于 70m1 蒸馏水。 再加入 0ml 甘油 , 2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以 :稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤,去除氧化膜。（2)伊红染液 :伊红有醇溶性与水溶性之分。将0、 5g 伊红溶于 00m1乙醇或蒸馏水即成

12、工作液 .、 染色程序（1)用0甲醛 (福尔马林 )固定培养物 0mi，或以丙酮固定 15mi。(2)蒸馏水洗 1 次后，入苏木精染液5 0mi染细胞核。（ 3) 入 0、 %盐酸 70乙醇溶液 31min, 脱去胞质得着色。 此时核呈紫红色 .(4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许,最好用自来水 (呈弱碱性）长时间浸泡。也可入 %NaHCO3 溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间 .( )蒸馏水洗 1 i ,去除残留得碱性溶液，否则影响伊红着色。(6）入伊红染液 3s1 i 。(）用梯度乙醇溶液脱水 :0、 9、 95%乙醇各 30 1mi ；100%（ 2 次)各

13、in。如伊红为乙醇溶液，略去70%乙醇。(8）用二甲苯透明2 次 ,各 5min。(9)树胶封固。、 1、 3 染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞得胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体（例如淋巴细胞 )则亦呈蓝色 .、 2 吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握 ,效果常不如 HE 染色稳定。1、 1 吉姆萨 (Gi m a)染液得配制(1)取 1、5g 吉姆萨粉末放入 5ml 甘油 ,置于 60温箱 ,约 3h 后溶解。（）取出后倒入 5 m中性甲醇 ,即为母液 .于棕色瓶可长久保存。需要注意得就是 ,有得甲醇内含醋酸 ,会使染液中得伊红沉淀出来,不利染色。(3)将母液与 、 1 mol