反刍动物粪中阿克醇浓度测定方法

1、ICS65.020.30B40DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/ TXXXX规模化羊场绒山羊舍饲管理技术规程反刍动物粪中阿克醇浓度测定方法Test method of for archaeol in ruminant点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/ TXXXX前言本标准按照标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写（GB/T 1.1-2009）起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本标准起草单位：内蒙古自治

2、区农牧业科学院。本标准主要起草人：孙海洲、张春华、李胜利、桑丹、张崇志、金鹿、珊丹、凌树礼、任晓萍、伶俐。5反刍动物粪中阿克醇浓度测定方法1 范围本标准规定了反刍动物粪中阿克醇浓度的测定方法。本标准适用于奶牛、绵羊、山羊等反刍动物粪中阿克醇浓度的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 3358.1 统计学词汇及符号 第1部分：一般统计术语与用于概率的术语3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。3

3、.1阿克醇archaeol阿克醇（2,3-diphytanyl-O-sn-glycerol，1,2-双植烷酸甘油）为反出动物瘤胃中产甲烷菌膜脂的基本结构，通过测定粪中阿克醇含量即可测算甲烷产量。3.2古细菌archaea常生活于热泉水、缺氧湖底、盐水湖等极端环境中的细菌。具有一些独特的生化性质，如膜脂由醚键而不是酯键连接，其营养方式亦不同于常规生物，如硫氧化等。包括3类不同的细菌：产甲烷细菌、极端嗜盐细菌和嗜酸嗜热细菌，已知的瘤胃古细菌绝大部分为产甲烷古菌。3.3相对相差 relative difference重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值。4 试剂和材料4.1

4、如无特别说明，所用试剂均为色谱纯试剂，水（应符合GB/T 6682）规定的一级水。4.2 二氯甲烷。4.3 甲醇。4.4 氯仿。4.5 磷酸二氢钾。4.6 氢氧化钾。4.7 盐酸。4.8 三甲基氯硅烷。4.9 N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。4.10 乙酸乙酯。4.11 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerol（1,2-双二十六烷基甘油）。4.12 1,2-di-O-phytanyl-sn-glycerol（1,2-双植烷酸甘油）。4.13 水溶液：所用的水用二氯甲烷（DCM）提取三次后使用。4.14 活化硅胶柱。5 仪器和设备5.1 气相色谱质谱联用仪，配有电子轰

5、击源（EI源）。5.2 分析天平（分度值0.0001 g）。5.3 超声仪。5.4 常规离心机。5.5 旋涡混匀器。5.6 旋转蒸发仪。5.7 水浴锅。6 样品处理6.1 样品采集和处理采集试验基地牛/羊新鲜粪便，于85 烘干72 h，研磨后以备分析。7 测定步骤7.1 总脂的提取7.1.1 全脂提取将内标1,2-双二十六烷基甘油（43.4 g；Santa Cruz Biotechnology Inc., CA)，加入到约300 mg干燥研磨后的粪样中（三份平行样），采用单相提取方法(Bligh and Dyer，1959)提取全脂，并用50 mL二氯甲烷提取3次。7.1.2 总脂提取加入单相

6、溶剂（2 mL）至粪样中，超声处理15分钟，990g离心5分钟，收集含有脂质的上清液。沉淀部分重复上述操作，共提取三次。合并上清液，加入2mL缓冲液与2 mL氯仿，旋涡混匀，990 g离心5分钟。收集有机相（底层），上层为水相，用2 mL氯仿冲洗水相2次，合并萃取物，转至旋转蒸发仪，用氮气旋转蒸发干燥，获得总脂。7.2 去除极性头基团获得的总脂中加入5mL的5%盐酸甲醇到总脂中，于密封管中100 加热3 h。冷却后，加入2 mL双蒸水和2 mL氯仿，产生有机相和水溶相。收集有机层（底层），水溶相用氯仿冲洗两次。合并萃取物，用氮气蒸发干燥。7.3 分馏脂质使用一个活化硅胶柱（0.5 g硅胶，60

7、*10-10 m粒度，125 活化，冷却至室温，立即转移到玻璃柱中）进行分离。玻璃柱预先用二氯甲烷处理（2倍柱容），总脂混合物加入柱内时也使用同一溶剂。非极性部分用二氯甲烷（3倍柱容）洗脱，接着醇部分用二氯甲烷:甲醇(1:1体积比，3倍柱容）洗脱。溶剂用N2气流蒸发干燥。7.4 GC-MS分析醇部分加入50 L含1 % 三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA+1%TCMS）中进行衍生化，70 加热1 h。接着BSTFA在N2气流中蒸发干燥。样品溶解于乙酸乙酯中，进行GC-MS分析。7.5 阿克醇定量分析7.5.1 色谱条件a）色谱柱：非极性固定相硅胶色谱柱（ZB-1，6

8、0 m0.32 mm0.1m；Phenomenex Ltd., Macclesfield,UK）。b）色谱柱温度程序：柱起始温度70 ，以20 /min升温至130 ，然后以2 /min 升温至300 。c）载气：高纯氮气。d）进样口温度：300。e）进样量：1 L。f）进样方式：手动进样。g）地址轰击源 ：70 ev。h）离子源温度：250 。i）GC-MS接口温度：250。j）选择离子监测：特征离子为m/z 130，278，284，426。7.5.2 标准曲线的制作通过加入100 ng/L的内标(1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerol; Mstd)，与古细菌膜脂标准

9、品(1,2-di-O-phytanyl-sn-glycerol; Mx)5,25, 50, 150及250 ng/L，利用GC-MS制作校准曲线。测定内标和膜脂标准品的峰面积Astd和Ax。标样质量（ng）的比值Mx/Mstd，与峰面积的比值Ax/Astd有一定的关系，具体的曲线回归方程式如下：Ax/Astd = 1.32 Mx/Mstd -0.0708因为曲线Ax/Astd在Y轴，运算结果是解出X轴的Mx/Mstd：Mx/Mstd = (Ax/Astd + 0.0708)/1.32每个样品加了43.4 g的内标，因此：Mx = (Ax/Astd + 0.0708)/1.32 43.4.7.6 平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行测定。7.7 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 8 结果计算和表述取两次测定的算数平均值作为结果，保留到小数点后一位。9 重复性每试样称取两个平行样进行测定，取平均值为分析结果。根据GB/T 3358.1，在重复条件下同一样品获得的测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10