第05章：核酸化学

1、第五章 核酸化学,核酸概述 核酸的化学组成 核酸的分子结构 核酸的重要性质 核酸研究技术,第一节 核酸概述,一、核酸的研究历史 1869 瑞士 F.Miescher从外科绷带脓细胞的细胞核中分离出一种有机物，称为核素，由于它有很强的酸性，后改称为核酸。,肺炎球菌转化实验,1944年 纽约 洛克菲勒研究所 Avery 加热杀死的S型肺炎球菌中有某种特殊的生物分子，可以使R型肺炎球菌转化为S型肺炎球菌 从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到R型肺炎球菌中 只有核酸可以使R型肺炎球菌转化为S型肺炎球菌。 结论：DNA是改变遗传性状的转化因子,1952年，美国冷泉港（c

2、old spring harbor） Hershey-Chase 噬菌体侵染细菌的实验,DNA重组技术,70年代初建立的DNA重组技术是基因工程的核心技术。,人类阔步迈进后基因组时代,1990年 美国 人类基因组计划（Human Genome Project，HGP） 30 亿美元 “人体地图” 10 万基因 1999年 中国加入HGP 2001年 Nature、Science共同发表 后基因组时代（post-genome era）：研究各种基因的功能与调节。,二、核酸的种类、分布和功能,（一）DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）; 功能：遗传信息的贮存； 分布：

3、 真核生物：细胞核为主，细胞器为辅； 原核生物：类核区、质粒 病毒,（二）RNA,核糖核酸（ribonucleic acid）； 功能：多样，主要参与遗传信息的表达； 主要种类：rRNA（ribosomal RNA） mRNA（messenger RNA） tRNA（transfer RNA） 分布：细胞质为主，细胞核为辅；病毒,第二节 核酸的化学组成,一、核酸的元素组成 基本元素：C、H、O、N、P 特点： 一般不含S； P含量恒定（DNA 9.9%，RNA 9.5%），可用定磷法进行核酸的定量分析。,核酸,核苷酸,二、核酸的分子组成,1、戊糖,核糖 （in RNA）,2-脱氧核糖 （in

4、DNA）,2、碱基,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,DNA,RNA,胞嘧啶 C,腺嘌呤 A,鸟嘌呤 G,稀有碱基,都是基本碱基的化学修饰型 嘌呤：如黄嘌呤（X） 、次黄嘌呤（I）等 嘧啶：如二氢尿嘧啶（D）、 5-甲基胞嘧啶等,鸟嘌呤,次黄嘌呤,3、核苷与核苷酸,C5,核苷酸命名：,M-单（D-二、T-三）；P-磷酸；d-脱氧 RNA中：某苷（单、二、三）磷酸 DNA中：脱氧+某苷（单、二、三）磷酸 稀有核苷酸命名与之类似,4、重要的核苷酸衍生物,1）ATP（腺嘌呤核糖核苷三磷酸）,生物体内能量的通用货币,物,物,NAD+、NADP+、FAD、CoA,2）辅酶核苷酸,结构中都含有腺苷酸组分,3）环化

5、核苷酸 cAMP、cGMP,功能：细胞之间传递信息（第二信使） 环状磷酯键是高能键。pH7.4水解能约为43.9kJ/mol,4）糖基载体 ADPG、UDPG,第三节 核酸的分子结构,一、核酸的一级结构 概念：各核苷酸残基沿核酸链的排列顺序 连接键：3,5-磷酸二酯键 方向：53,-H2O 酯键相连,3,5-磷酸二酯键,首,尾,A,核苷酸,5 pApGpCpTpGpC-OH 3,5 AGCTGC 3,5,3,表示方法：结构式、线条式、字母式,二、DNA的高级结构,（一）二级结构,指的是DNA的双螺旋结构。,1953年，Watson和Crick 根据DNA中碱基的物化数据和酸碱滴定、DNA碱基组

6、成的定量分析、DNA纤维的X-衍射图谱，提出了DNA双螺旋结构模型。,Chargaff定则： 1）碱基组成有种属的特异性，但没有组织器官的特异性； 2）在DNA中，A=T，G=C； 3）生物DNA碱基组成不会因为年龄、营养、环境的改变而改变。,DNA纤维的X-衍射图谱,不同来源的DNA具有相似的图谱-均匀的双螺旋构造、0.34nm,F. Crick (35y),1951,J. Watson (23y),剑桥大学 Cavendish Lab.,DNA分子由两条多核苷酸单链组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋。螺旋中的两条链方向相反，一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，螺旋上有

7、一个大沟和一个小沟。,1、DNA双螺旋结构的要点,碱基位于螺旋内侧，磷酸和脱氧核糖位于螺旋外侧，形成DNA分子的骨架。碱基平面与螺旋轴垂直，糖环平面与螺旋轴平行。,螺旋横截面的直径约2 nm，相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10bp形成一个螺旋，螺矩3.4 nm。,螺旋内部碱基配对存在，AT之间形成两个氢键，GC之间形成三个氢键； 碱基在一条链上的排列不受限制。,2条单链，反向平行，右手螺旋，大沟小沟 骨架（磷酸、戊糖），内侧（碱基），垂直，平行 直径2nm，10bp/螺旋，螺距3.4nm 碱基配对存在 碱基排列不受限制,2、意义,大大推动了分子生物学和分子遗传学的发展，被誉为2

8、0世纪最伟大的发现之一。 第一次准确地阐述了DNA作为遗传信息的结构基础和遗传信息传递的基本方式； 最主要的成就是碱基互补配对。,3、稳定因素,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。 稳定因素： 氢键 碱基堆积力（以疏水作用力为主） 离子键,4、DNA螺旋结构的多样性,B-DNA：相对湿度为92%时的DNA钠盐 A-DNA：相对湿度为75%以下时的DNA纤维 Z-DNA：左手螺旋,B-DNA,ts-DNA 三股螺旋,（二）DNA的再压缩及包装,数据：人的体细胞DNA长2m，细胞核直径0.05mm。 DNA双螺旋分子需要进一步扭曲和折叠以压缩分子空间。 原核生物DNA、真核生物细胞器DNA进一步形

9、成超螺旋。真核生物染色体DNA则进一步形成核小体。,负超螺旋,反之，则为正超螺旋 自然界通常为负超螺旋,原核拟核DNA的包装,真核细胞核DNA的包装,真核生物染色质的基本单位是核小体。 核小体由200bp DNA和组蛋白（1:1）构成。 组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成组蛋白八聚体，DNA双螺旋分子缠绕其上1.75圈（146bp），形成核小体的核心颗粒。 核心颗粒之间由DNA和组蛋白H1连接。,三、RNA的结构,戊糖是核糖，碱基中有U，而没有T； 大多数RNA分子是单链，不遵守碱基种类的数量比例关系； 局部的碱基互补配对（A-U、C-G），不能配对的部分，形成突环-发夹/茎环结构；

10、 总结：RNA分子是含短的不完全螺旋区的多核苷酸链。,（一）tRNA的结构与功能,1、一级结构特点与功能 功能：转运活化aa到核糖体，与mRNA配对。 每一个aa至少有一个相应的tRNA（如tRNAAla）。 3端为CCA-OH，5端多为G，也有C。,大小相似，7090Nts，平均沉降系数4S。 分子量最小，修饰碱基最多，约占RNA总量的10%15%。,四臂,稀有碱基,三叶草型 （cloverleaf）,2、二级结构,四环,氨基酸接受区 包含有3-端和5-端 3-端是CCA 功能：携带活化Aa 反密码区 环正中的3个核苷酸残基组成反密码子 功能：通过反密码子与mRNA配对，决定Aa的正确位置,

11、二氢尿嘧啶区（D区） 功能：氨酰-tRNA合酶的结合位点 TC区 此环基本含有TC 功能：结合核糖体 可变区（额外环） 变化较大，是不同tRNA的区别之处,3、三级结构,在二级结构的基础上，突环上未配对的碱基通过整个分子的扭曲而配对 已知tRNA的三级结构均为倒L形。,功能：从DNA接受遗传信息，并传递到核糖体，作为模板指导蛋白质合成。 不同mRNA的碱基组成和分子量差异很大。 种类最多，寿命最短，比例最低，约占RNA总量的3%5%。,（二）mRNA的结构与功能,原核细胞mRNA： 多顺反子 5端无帽子结构 3端无polyA尾巴,真核细胞mRNA： 单顺反子 5端有帽子结构 3端有polyA尾

12、巴,顺反子：能够合成一条多肽链的核苷酸片段。 polyA片段：指20250个多聚腺苷酸。 “帽子”结构：甲基化（ 碱基）的鸟苷酸，与mRNA的5端核苷酸以5, 5-三磷酸相连。目前已发现三种类型：O型、I型、II型。,I型帽子结构：,G甲基化,OCH3,甲基化,H,任意碱基,m7G 5ppp5 NmpNp,（三）rRNA的结构与功能,功能：是核糖体的主要组成部分。与蛋白质生物合成相关，可能催化肽键的形成。 比例最大，分子量最大，约占RNA总量的80%。 常见甲基化修饰。,核糖体的组成,mRNA,rRNA,tRNA,一、核酸的水解 1、酸水解：嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键 磷酸酯键； 2、碱水解：DNA

13、比RNA耐碱（RNA常温碱解） 3、酶水解：切开核酸链中的磷酸二酯键。,第四节 核酸的重要性质,根据作用方式分：外切酶和内切酶 外切酶：从核酸链的3-端或5-端开始，依次逐个水解核苷酸； 内切酶：从核酸链中间某个位点切断磷酸二酯键。其中限制性核酸内切酶能识别并水解核酸中某些特定碱基顺序。,二、核酸的酸碱性质,核酸具有两性性质； 磷酸（中强酸）+ 碱基（弱碱）核酸pI比较低 DNA的pI为44.5，RNA的pI为22.5； 原因：RNA分子中核糖2-OH通过氢键促进磷酸基团中质子的解离。,三、核酸的紫外吸收特性,碱基具有共轭双键体系核酸具有独特的紫外吸收光谱 max = 260nm 核酸及其组分

14、定性定量测定的依据,纯DNA：OD260 / OD280= 1.8 纯RNA：OD260 / OD280= 2.0 若含有杂蛋白及苯酚，则比值明显降低 OD260 = 1.0 = 50g/mL双链DNA = 40g/mL单链DNA/RNA = 33g/mL (d)NTP,四、核酸的颜色反应,DNA（2-脱氧核糖）+二苯胺在酸性条件下形成蓝紫色化合物； RNA（核糖）+苔黑酚在浓盐酸和加热条件下形成绿色化合物。,五、核酸的变性、复性和分子杂交,（一）变性（denaturation） 1、定义：某些理化因素破坏核酸中的氢键，使双螺旋结构变成单链 “线团”的过程。 2、变性因素：温度升高、pH改变、

15、甲醛、尿素等。,3、DNA变性的特征： 生物活性丧失； 260nm紫外吸收值增加（增色效应）；粘度下降，比旋下降，浮力密度增加； 结构松散，容易被酶解； 分子量不变,4、核酸的热变性和解链温度（Tm）,DNA的热变性达到50%时的温度-DNA的解链温度（melting temperature，Tm）, 也称熔解温度或DNA的熔点。 Tm是DNA的特征常数。,影响Tm值的因素：,GC的比例：GC含量高，Tm值高。 （G+C）%=（Tm-69.3）2.44,DNA的均一性：均一性较好，则DNA变性温度范围较小；,介质的离子强度：离子强度越高，Tm越高,（二）复性（renaturation）,1、定

16、义：变性DNA在适当的条件（缓慢降温、一定浓度盐溶液）下，两条分开的单链可以通过碱基配对重新形成双螺旋结构，又称为退火（annealing） 。,2、复性DNA的特征,减色效应，比旋上升，粘度上升，浮力密度下降；生物学活性恢复,3、影响复性的因素,温度控制：逐步降低比快速降低好 盐离子浓度：浓度大有利于复性 DNA浓度：越高越有利 DNA片段大小：片段越大，越不容易,（三）分子杂交（hybridization）,定义：不同来源的核酸单链（DNA、RNA）通过碱基配对形成杂合分子的过程。 特点：灵敏度高、专一性强,应用：,Southern blot-DNA杂交 Northern blot-RNA

17、杂交,Northern blot（RNA杂交）,操作基本与Southern blot相同。 主要区别： 电泳前无需酶切； 转印前无需变性； 探针为RNA。,第五节 核酸研究技术,一、核酸分离提取的一般原则,1、DNA的分离提取： 要求：防止污染，操作温和，杂质除尽 方法： 1）少量：盐溶液抽提，苯酚-氯仿除蛋白； 2）大量：氯化铯密度梯度离心；,2、RNA的分离提取：,注意： 1）用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理12h后高压灭菌； 2）提取过程中加入RNase抑制剂。 方法： 1）少量：异硫氰酸胍 + 苯酚-氯仿； 2）大量：胍盐/氯化铯密度梯度离心 蛋白质 1.89g/cm3,二、核酸

18、电泳-琼脂糖凝胶电泳,以琼脂糖作支持介质的水平电泳。 制备容易，分离范围广，尤其适用于分子量较大样品（大分子核酸、病毒等）的分离；但分辨率（100bp）比PAGE（1bp）低。 样品易回收，可用于制备。,影响迁移率的因素 电压：成正比； 凝胶浓度：成反比； 核酸分子大小：成反比； 质粒DNA构象：超螺旋 线性 闭环,1985年，美国的Mullis发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。 其原理类似于DNA的体内复制 1993年获得诺贝尔奖,三、PCR（聚合酶链式反应）技术,原理：模拟DNA的体内复制，通过热变性-退火-延伸的不断循环，使目标序列得到几何级数的扩增。 步骤： 1）变性：95左右，模板双链DNA变性成单链； 2）退火：50-60左右，引物与模板的互补区段结合； 3）延伸：72，DNA聚合酶将dNTPs连续添加到引物的3-OH末端。 体系：template、primers（2种）、dNTPs、Taq DNA pol、10buffer（含Mg2+）、矿物油,四、DNA序列测定,19751977，Sanger发明并改进了双脱氧链终止测序法,学 习