新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法

1、1,第三章 分子发光分析法,2,第一节 概述,分子发光（molecular luminescence） 某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后，返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来的分析方法很为非自发光分析法。,3,分子磷光,分子荧光,分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。,本章重点,掌握分子荧光分析法、化学发光分析法 了解生物发光分析和分子磷光分析,4,5,第二节 分子荧光分析法,一、分子荧光和磷光的产生,1、电子自旋状态的多重性,*,n,*,n,*,n,*,n,*,n,激发单重态 S=0 M=2S+1=1,单重态S S=0 M=

2、2S+1=1,*n,* ,三重态T S=1 M=2S+1=3,总自旋量子数,6,S2,S1,S0,S2,S1,S0,S2,S1,S0,T2,T1,S0,T2,T1,S0,单重第一激发态S1,单重基态S0,单重第二激发态S2,第一激发三重态 T1,第二激发三重态T2,能量： S2 T2 S1 T1 S0,7,能量： S2 T2 S1 T1 S0,8,2、无辐射跃迁,辐射跃迁,9,2）内转换（IC） 同一多重态的不同电子能级间振动能级部分重叠，电子由高电子振动能级转移到低电子振动能级的过程。产生时间10-1110-13s,1）振动弛豫（VR） 在同一电子能级内，激发态分子通过与周围分子碰撞而将多余

3、能量以热的形式传递给周围分子，自身由高振动能级回到低振动能级的现象。产生时间10-12s,10,11,3）系间窜跃(ISC) 不同多重态间有振动能级的重叠，分子由激发单重态（S1）跨越到激发三重态(T1)的过程，电子需要自旋反转。所需时间10-6s,12,13,3、分子荧光和磷光的产生及类型,（1）分子荧光,瞬时荧光(快速荧光) 分子由第一激发单重态（s1）的最低振动能级单重基态(s0) 所产生的辐射光。为单重态间的跃迁，概率大，过程快10-8s,延迟荧光,单重基态(s0),分子跃迁至第一激发三重态（T1）,碰撞 激活,第一激发单重态（S1）,振动弛豫,S1的最低振动能级,荧光,14,15,由

4、于振动弛豫和内转换损失部分能量， 发射荧光的能量比激发光的能量小，波长要长， 这种现象称为斯托克斯位移（Stokes shift）,ex最大激发光波长； em最大发射光波长,斯托克斯位移越大，激发光对荧光测定的干扰越小,16,电子改变自旋，且在亚稳态T1停留较长时间以及分子碰撞能量损耗大。磷光能量更低，波长更长。发光速度很慢： 10-410s,（2）分子磷光,单重基态(s0),受激分子降至S1最低振动能级,T1,系间窜跃,T1的最低振动能级,磷光,振动弛豫,17,18,二、分子荧光的性质,1、荧光激发光谱,19,（1）激发光谱的绘制 固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光

5、波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度 的变化。F纵坐标， ex(激发波长)横坐标,20,（2）激发光谱的特点,a.不论第二单色器选择何处作为固定测定波长，不影响谱线的形状,b.激发光谱与该物质的吸收光谱非常近似，同一物质最大激发波长与最大吸收波长一致。,21,2、荧光发射光谱（荧光光谱） （1）荧光光谱的测绘 固定第一单色器，保持激发光的波长和强度， 改变第二单色器，测定发射的荧光在各个波长下的相对强度， 记录荧光强度（F）对发射波长（em）的关系曲线,22,（2）荧光光谱的特性,a.发射光谱的形状与激发波长无关 分子无论被激发到哪一个激发态，最终均回到第一激发单重态的最低振动能级再回到基

6、态，产生分子荧光。,b.荧光光谱与吸收光谱有镜像关系,荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,23,镜像关系?,ex =290nm (MAX),固定em=620nm(MAX),固定ex=290nm (MAX),em= 620nm(MAX),1 4,1 3,1 2,11,1 1,1 2,1 3,1 4,24,三、分子荧光的参数,1.荧光寿命 处于激发态的荧光体返回基态前停留在激发态的平均时间， 处于激发态的分子数目衰减到原来的1/e所需要的时间,2.荧光量子产率,0 f 1,25,四、荧光强度的主要影响因素,1.

7、荧光强度与浓度,荧光体浓度很稀,荧光分析适用于微量组分或痕量组分分析,26,1）共轭键体系 跃迁类型：* 的荧光效率高，提高共轭度有利于增加荧光效率，环越大，红移程度越大，发光越强,2.荧光与分子结构,27,2）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。,无荧光,发荧光,28,3）取代基效应,给电子取代基-OH,-CN，-NH2等，可扩大共轭双键体系加强荧光,得电子取代基=C=O, -NO2 -COOH，-SH等减弱荧光，加强磷光。,重原子效应：芳环上取代F、Cl、Br、I之后，系间窜跃加强，荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光则增强。,取代基的位置：邻、对位荧光增

8、强，间位抑制,29,4）电子跃迁类型,n *系间窜跃强烈，荧光很弱, *，易发生，大，荧光强,30,3.荧光猝灭 定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度减弱的现象。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。,31,主要类型,1）自猝灭,M *+ M Mn,2）电荷转移猝灭,M（甲基蓝）,M *,M +em（荧光）,ex,M *+Fe2+,M -+Fe3+,I-CNS- Br- Cl- C2O42- SO42- NO3- F-,猝灭的强弱顺序,32,3）转入三重态的淬灭,含溴化物、碘化物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物及某些杂环化合物容易转变为三重态， 因而易使荧光淬灭,氧

9、的存在会增强系间窜跃。,4）光化学反应 某些光敏物质吸收光辐射后，发生了化学反应或预离解,33,5、表面活性剂的影响,当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度， 会缔合为球状胶束，对荧光物质起到保护作用,4、温度、酸度和溶剂的影响,34,特点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：10-1010-12g/ml 2.选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱； 3.试样量少 缺点：应用范围小。,五、荧光定量分析方法,35,定量依据与方法,定量依据,方法,工作曲线法,比较法,荧光猝灭法,多组分混合物荧光分析,a无相互干扰，分别测定 b有干扰，同紫外可见吸收光谱定量

10、方法 解联立方程组法 等吸收双波长消去法,36,荧光分析注意事项,a.防止荧光污染 器皿、溶剂、洗涤剂、滤纸、润滑油等,b.防止散射光的干扰 丁铎尔散射光、瑞利散射光、拉曼散射光的干扰 可通过选择合适的测定波长，滤光片等手段加以消除,37,六、 荧光分光光度计,国产970CRT型,38,1.仪器主要部件： 激发光源、双单色器系统、样品池、检测器 特殊点：有激发和发射两个单色器，光源与检测器通 常成直角。 光源：氙灯（250800nm） 单色器： 选择激发光波长的第一单色器 选择发射光(测量)波长的第二单色器； 样品池：石英比色皿 (四面透光) 检测器：光电倍增管。,39,40,2.仪器的灵敏度

11、,规定：在特定条件下能检出0.05mol/LH2SO4介质中硫酸奎宁的最低浓度为灵敏度。,灵敏度：10-1010-12g/mL,绝对灵敏度,41,第三节 分子磷光分析法,磷光现象：T1 S0,主要有：低温磷光分析、室温磷光分析,42,一、低温磷光分析,溶剂条件：,易于制备、提纯 溶解能力强（很好的溶解分析物） 在77K下有足够黏度并能形成刚性玻璃体 背景低，在所研究的光谱区无明显吸收，发射,43,二、室温磷光分析,将试样固定在滤纸、硅胶、Al2O3、玻璃纤维、淀粉KBr等基体上，以增加其刚性，减少三重态碰撞猝灭，增加强度。,胶束稳定的溶液室温磷光分析（MS-RTP）,环糊精室温磷光（CD-RT

12、P）,44,第四节 化学发光分析法,化学发光 (CL) ：由化学反应的能量把分子激发,从激发态返回到基态，产生光辐射的现象。 化学发光分析法：依据待测物浓度与体系的化学发光强度的关系，确定待测物含量的一种痕量分析方法。 特点：灵敏度高、线性范围宽、设备简单、分析速度快 易实现自动化,45,一、化学发光分析的基本原理,1、化学发光反应的基本条件 发光反应必须满足以下条件 a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态。 在紫外可见光区观察化学发光，160420kJmol-1激发能。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。,b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回

13、基态,46,2.化学发光效率,化学发光效率CL,激发态分子的产率,激发态分子的发光效率,大于0.001%的发光反应称为强化学发光 1.0 10-6 % 1.0 10-3 %为弱化学发光 小于1.0 10-6 % 为超微弱化学发光,47,3.化学发光强度与反应物浓度的关系,化学发光强度 ICL取决于化学发光反应的转化速率 发光效率与单位时间反应物浓度变化的乘积,发光总强度,恒定，发光总强度与被测物浓度c成正比,48,4.灵敏度和检测限,灵敏度：取决于环境污染，干扰及排除,检出限,S0空白信号标准差,m被测物工作曲线斜率,仪器越稳定S0,Cl越高m,DL,49,二、化学发光分析的类型,1. 液相化

14、学发光 鲁米诺（Luminol） 光泽精 过氧草酸盐 没食子酸、洛粉碱等。,50,1）鲁米诺体系（3 氨基苯二甲酰环肼）,425 nm,鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、H2O2、O2和NO2，也可测催化金属离子。化学发光效率为1%,51,+H2O2,+,2,+ h（max=470mm）,（N-甲基吖啶酮）,催化剂,OH-,2)光泽精体系N，N-二甲基-9，9-联吖啶二硝酸盐,52,可测Fe2+ ,Fe3+，Cr3+ ,Mn2+ ，Ag+，Pb2+ ,Bi3+等 可测丙酮、羟胺、果糖、Vc、尿素、肌酸酶等 可作为化学发光探针，测全血中吞噬细胞的活性,53,+ fluorophor,f

15、luorophor*,荧光体,fluorophor + h,+ 2CO2,常用的双（2，4，6-三氯苯基）草酸酯TCPO 双（2，4-二硝基苯）草酸酯DNPO,3)过氧草酰体系,可测甲醛、甲酸、葡萄糖、氨基酸等,54,55,2、气相化学发光,常温下气体: O3、NO、NO2、SO2、H2S、C2H4等,火焰中化学发光,NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h（600nm） 灵敏度1ng/ml,SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h (280nm) 灵敏度0.001g/ml；,S + S 2S2 * S2 * S2 + h（394nm）,NO+H HN

16、O* HNO + h（690nm）,56,三、化学发光分析仪器,1、分立取样式液相化学发光仪,静态测定 特点 设备简单、便宜 可记录化学反应全过程 速度慢、精密度差,57,三、化学发光分析仪器,2、流动注射化学发光仪,动态测量 特点 自动化、精密度高、分析速度快 适于批量测定,流动注射化学发光仪器,58,1.溶液酸度：影响存在形态，发生副反应 2.试液的注入速率：速率越大，发光强度变化越大 3.共存干扰物：引起猝灭,四、影响液相化学发光的主要因素,59,五、生物发光分析法,生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过 化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。 以此建立的分析技术为生物发

17、光分析法,60,例：荧光素测定ATP,LH2+ATP+Mg2+E,AMP.LH2E+MgP2O7,pH=78,(荧光素),AMP.LH2E+O2,激发态氧化荧光素+AMP+CO2+H2O,氧化荧光素+h（562nm）,量子产率Cl1,灵敏度（检出率）2.010-17mol/LATP， 可用于细菌计数测定。,(荧光素酶),61,第五节 实验技术,1、时间分辨技术 根据荧光产生时间和衰减速率的差异。对不同组分进行分析,一、分子荧光、磷光分析实验技术,62,2、室温固体基质发光 基体表面加入敏化剂，增强对激发光的吸收 3、无保护流体室温磷光法 对某些适宜的化学结构和跃迁类型（含重原子） 在无保护介质的室温下，也能产生磷光,63,二、化学发光和生物发光分析实验技术,1、偶合反应技术,发光反应,D * D + h,A + M C,C,偶合反应,L+H2O2,2、免疫发光技术,用发光基团作为免疫标记 辣根过氧化物酶（HRP） 可催化鲁米诺体系,64,3、分离分析在线发光技术,将流动分析技术、色谱分离技术与化学发光相结合,4、电生化学发光技术,通过电极反应诱发溶液