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文档简介

1、二、基因表达载体的构建,1、为什么需要构建基因表达载体？,2、如果运载体是质粒,如何构建？,基因表达载体的组成：,目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点,它们有什么作用？,三、将目的基因导入受体细胞,1.转化,2.常用的受体细胞,3.将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,三、将目的基因导入受体细胞,4.方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目

2、的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的

3、基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 即真正被用作载体的质粒都需在天然质粒的基础上进行人工改造， 且受体细胞不同，导入方法不同，均需构建。,基因表达载体的构建,基因表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中存在，并且遗传给下一代；使目的基因表达和发挥作用 启动子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录产生mRNA 终止子 ：位于基因的尾端。终止

4、转录 标记基因：检测受体细胞是否含有目的基因,农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物；Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 转化:目的基因插入TDNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达,农杆菌转化法,操作程序： 目的基因表达载体提纯取卵（受精卵） 显微注射体内发育新性状动物,显微注射技术,2.微生物作受体细胞原因：,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,将目的基因导入微生物细胞,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序

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