酪蛋白的提取与测定

1、牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定一、实验目得1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理 :牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质 ,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得 80%、牛乳在 PH。 7 时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质 ,不溶于水、乙醇等有机溶剂 ,但溶于碱溶液。 乳清蛋白不同于酪蛋白 ,其粒子得水与能力很强 ,分散性高 ,在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低得原理 ,将牛乳得 PH

2、 调至 4。时 , 酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物 ,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理 :大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在 ,在紫外光 280nm 有吸收高峰 ,可以进行蛋白质含量得测定。 但就是核酸在 80nm 也有吸收 ,干扰测定 ,不过核酸得最大吸收峰在 0nm,通过测定在 28 nm 与 260时得比值 ,然后通过计算消除核酸存在得影响 ,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理 :考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合 ,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝 250 得磷酸溶液呈棕红色 ,最大吸收峰在 465nm

3、、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色 ,其最大吸收峰改变为 5 5n,考马斯亮蓝 G 5蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。在一定范围内 ,考马斯亮蓝 G250蛋白质复合物呈色后 ,在 595nm 下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系 ,故可以用于蛋白质浓度得测定。三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白 :烧杯、玻璃棒、量筒、精密 PH 试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9%乙醇、无水乙醚、紫外光吸收法 :紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(1)、石英比色皿0.9Nal、 1 o LNaOH 溶液、 1ol/ 乙酸溶液3、考马斯亮蓝法 :紫外可见光

4、分光光度计、试管 1 5cm 5cm(9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白 (0.1g l) 、考马斯亮蓝、 0。 9% aCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将 20mL pH。得醋酸 -醋酸钠缓冲液预热至40、将 2牛奶加热至 0 ,在搅拌下缓慢地加入20 L 预热得 H4。7 得醋酸 醋酸钠缓冲液3、用精密 pH 试纸调 p至 4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液、待悬浮液冷却至室温,400 m 离心 5min,弃上清 ,得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3 次 ,3000rm 离心 5min,弃上清6、在沉淀中加入 20m 5乙醇 ,搅拌片刻 ,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇 乙醚混合液洗涤沉

5、淀 2 次(1ml 次 ),最后用乙醚洗涤沉淀 2 次(1 m/次 ),抽干8、将沉淀摊开在表面皿上,风干 ,得酪蛋白纯品、准确称量 ,计算含量与得率紫外光吸收法 .取待测样品溶液置于得石英比色皿中 ,于分光光度计波长 80 m 与260nm,分别读取 A 8 nm 与 A20nm,用生理盐水为比色空白对照。2.若 A280nm/A 60nm、 5,用公式 :蛋白质含量 ( g/l)=A 8 n 6、31若 A 80m/2 n1。5,用公式 :蛋白质含量 (gml) 4 280nm 0。 7 260nm考马斯亮蓝法取支干净试管 ,按表进行编号并加入试剂、混匀 ,室温静置 mi ,以第 1 管为空白 ,于波长 95nm 处比色 ,读取吸光度 , 以吸光度为纵坐标 ,各标准液浓度 ( g/m)作为横坐标作图得标准曲线。五、实验数据酪蛋白质量 :0.421g酪蛋白含量 :.7g/ l 牛乳紫外光吸收法 :280m 076AA 260n0.5280nm/ 60 m1。5,蛋白质含量 (mg/ml)= 。 A 280 m . 4 260nm =0、 405m/ml考马斯亮蓝法管号1( 空 2357白 )标准蛋白液00、 1 。0.30。0、 60.8-ml样品 ml-110.9%N 10、 90。0、7、60。 40、20/考马斯亮蓝染4。04