霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)

1、霉菌与酵母菌计数方法1 试验菌液得制备与使用( 以白色念珠菌为示例 )白色念珠菌 (0) 代传代培养实验菌液得制备 : 沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基 , 培养温度 20 5, 培养时间 23 天计数培养基适用性检查 : 胰酪大豆胨琼脂培养基, 培养温度 03 ,培养时间不超过5 天, 接种量不大于 10 c u计数方法适用性试验 : 胰酪大豆胨琼脂培养基( P法不适用 ), 培养温度 5 , 培养时间不超过天 , 接种量不大于 10cfu注 : 当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时 , 应进行培养基适用性检查 , 检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1. 菌种试验用菌株得传代

2、次数不得超过代( 从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0 代 ), 并采用适宜得菌种保藏技术进行保存, 以保证试验菌株得生物学特性。1。 2 菌液制备 ( 按表 1 规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物用 pH7、0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或0、 9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物加入 3含 0. %聚山梨酯 80 得 pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或0、9无菌氯化钠溶液 , 将孢子洗脱采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内用含 0。05聚山梨酯 80 得 p 7. 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或0。 %无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下

3、放置, 应在 2 小时内使用 ; 若保存在 8, 可在 24 小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2 , 在验证过得贮存期内使用、1。阴性对照为确认试验条件就是否符合要求, 应进行阴性对照试验 , 阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长 , 应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表 1 规定 , 接种不大于 100cu 得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板置表规定条件下培养每一试验菌株平行制备2 管或 2 个平皿同时 , 用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在 0。5-2 范围内 , 且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落

4、一致 ; 被检液体培养基管与对照培养基管比较 , 试验菌应生长良好3 计数方法适用性试验供试液制备 : 水不溶性非油脂类供试品取供试品 , 用 pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液, 或 pH7。2 磷酸盐缓冲液 , 或胰酪大豆胨液体培养基制备成 :10 供试液。若需要 , 调节供试液 H值至 68。必要时 , 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释、接种与稀释所加菌液得体积应不超过供试液体积得 1、为确认供试品中得微生物能被充分检出, 首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。实验组供试品对照组菌液对照组取上述制备好得供试液取制备好得供试液取不含中与剂及灭活剂得相应稀释液替代供

5、试液加入试验菌液 ,混匀加入稀释液 ,混匀加入试验菌液 ,混匀使每 1m供试液中含菌量不使每 1m 供试液中含菌量大于 100c u不大于 100c u使每 m供试液中含菌量不大于 100cfu4 抗菌活性得去除或灭活供试液接种后 , 按下列“微生物回收 规定得方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值小于菌液对照组菌数值得 50, 可采用下述方法消除供试品得抑菌活性、 加稀释液或培养基体积、 入适宜得中与剂或灭活剂采用薄膜过滤法。5 供试品中微生物得回收表 1 所列得计数方法适用性试验用得各试验菌应逐一进行微生物回收试验、微生物得回收可采用平皿法、薄膜过滤法或 PN法。 (

6、 预方法就是平皿法 ) 平皿法包括倾注法与涂布法。表 1 中每株试验菌每种培养基至少制备2 个平皿 , 以算术均值作为计数结果。( ) 倾注法取照上述“供试液得制备” 、“接种与稀释”与“抑菌活性得去除或灭活 制备得供试液 1l置直径 90mm得无菌平皿中注入 1 20m温度不超过5熔化得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀 , 凝固 , 倒置培养、 ( 若使用直径较大得平皿, 培养基得用量应相应增加)按表 1 规定条件培养、计数同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组得平均菌落数。(2) 涂布法取 1520l 温度不超过 45得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基注入直径 9

7、m得无菌平皿 , 凝固 , 制成平板采用适宜得方法使培养基表面干燥( 若使用直径较大得平皿 , 培养基用量也应相应增加 ) 每一平板表面接种上述照“供试液得制备”、“接种与稀释 与“抑菌活性得去除或灭活”制备得供试液不少于。ml按表 1 规定条件培养、计数同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组得平均菌落数6、结果判断计数方法适用性试验中 , 采用平皿法或薄膜过滤法时 , 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值与菌液对照组菌落数得比值应在 0.52 范围内验均符合要求 , 照所用得供试液制备方法及计数方法进行该供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数。7、供试品检查( ) 除另有规定外 , 一般供试品得检验量为10g 或 10ml;( ) 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数; 沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌与酵母菌总数。(3) 培养与计数除另有规定外 , 胰酪