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块状非晶态Mg-Zn-Ca合金在细胞的反应与腐蚀.doc

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块状非晶态Mg-Zn-Ca合金在细胞的反应与腐蚀.doc

文献翻译块状非晶态MGZNCA合金在细胞的反应与腐蚀摘要通过块状非晶态MGZNCA合金(主要有MG66ZN30CA4与MG70ZN25CA5)的微观组织结构观察、表面性能测试、机械性能检测、腐蚀与生物毒性的测试,研究验证其作为生物植入材料的可行性。研究发现,通过观察微观尺度下均匀分布的蚀孔中的腐蚀产物,MG66ZN30CA4合金具有与冷轧纯镁和MG70ZN25CA5合金相同的腐蚀形态。其腐蚀产物主要都是与MG(OH)2和ZN(OH)2,并且腐蚀机理都是一致的。利用L929和MG63细胞株系在合金上进行间接的细胞毒性测试和直接的细胞培植试验,结果显示,MGZNCA合金上的细胞存活率较冷轧纯镁上的高,并且发现L929和MG63细胞在MG66ZN30CA4表面上有明显的黏附和增生。关键词镁合金非晶态合金机械性能腐蚀细胞毒性1、引言近年,镁合金作为生物植入材料广受关注15。引起众多兴趣的原因在于镁合金具有良好的机械力学性能、生物相容性和可降解性6。有些研究者将人体必需的元素ZN和CA加入镁中形成的镁合金应用于镁合金的生物安全性和生物相容性的研究35,7。例如,张等,研究报道过MGZN合金具有很高的抗拉强度(2785MPA),并且锌离子的释放不会对人体造成伤害。我们的研究表明MG1CA合金在骨骼的植入部位的腐蚀降解速率为228MG/MM2/YR。并且在镁合金还会促进植入部位周围的骨骼组织的生长5。然而,在实际应用中,镁合金的腐蚀降解仍面临更多的挑战。第一,原本必需的镁合金固有的机械强度会随着腐蚀降解的进行会降低7。张等,曾发表MGZN合金的机械强度在腐蚀的最初阶段下降的速度很快(当合金失重6时,强度有625MPA降至390MPA)。第二,镁合金经常遭受不同类型的腐蚀。点蚀是镁合金在中性或碱性溶液中腐蚀的典型模式8,并且腐蚀沿着蚀坑的方向向周围扩展造成镁合金在一定的腐蚀时间过后失效5,9。WITTE等2,研究表明LAE442和AZ91D合金植入猪腿骨18周后,其表面会呈现不规则的粗糙表面。我们以前的研究也发现MG1CA合金在骨骼中的腐蚀出现不同的腐蚀产物5,并且由于点蚀造成的合金表面缺陷也会加快镁合金机械强度的下降。第三,现在常用的镁合金在生物体液环境中的腐蚀降解速度大于骨骼组织的自我恢复速度5,6,10,并且腐蚀过程会释放氢气并使腐蚀环境的碱化1,11对周围的生物组织造成危害。因而,研究一种新的镁基生物材料,使它具有良好的机械性能,较低的腐蚀速度的同时产生同样的腐蚀产物,应用于临床应用是非常必要的。由于镁基非晶态合金只具有一种相态而广受关注,其具有与普通镁合金相同的化学性质并且没有第二相1214,这些性质会使合金的机械性能和腐蚀阻抗增加,并且其腐蚀产物是相同的。镁基非晶态合金有着长足的发展研究,产生包括MGCUY、MGNIY、MGCUGD和MGZNCA在内的各种合金12。其中,MGZNCA展现了非常合适的机械强度,其单位体积质量强度()在250300MPACM3/G范围内15,其比常规晶态镁合金高出40(铸造AZ91D和WE43的强度分别为220MPACM3/G、176MPACM3/G16)。通过增加人体必需的ZN和CA17,18元素增加合金的生物相容性,使得MGZNCA非晶态合金称为最合适的生物植入镁合金。在本次的研究中,着重研究镁基非晶态合金具有良好的非晶态形成能力(GFA),和MG66ZN30CA4与MG70ZN25CA5的腐蚀产物与细胞相容性。2、试验21合金制备以纯度大于999的MG、CA和ZN粒,在氩气的气氛的熔炉中进行熔炼,形成均匀的混合(按原子比例混合)的合金。将熔化的合金通过石英管注入直径为2MM的铜模具中。利用X衍射仪鉴定铸造MGZNCA合金的非晶态性,通过RIGAKU的DMAX2400衍射仪,射线源为CUKΑ靶进行样品组织分析,并且利用差示扫描量热法(DSC)(PERKINELMER公司,DIAMONDDSC测量仪)控制温差为40K/MIN的热传导进行样品与参比物的功率差和温度的关系。将铸造MG66ZN30CA4和MG70ZN25CA5合金样品切割为2MM厚度的圆盘并用2000号砂纸将其表面打磨光滑,然后进行电化学试验。所有的样品必须经过丙酮、无水乙醇和蒸馏水的超声波清洗。对于要进行细胞培植试验的磁盘状样品,必须在紫外线辐射下照射至少2H进行灭菌处理。22机械性能测试拉伸性能测试试验是按照ASTM标准进行,试样为Φ2MM长为4MM的圆柱。在室温中,利用8562拉伸轻度试验仪在2104S1的应变率的速度下进行单向静压缩试验。23电化学测试电化学特征常用三电极电池装置测量,试验用铂作辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。在试样上连接导线,除试样末端的表面(裸露部分表面积为314MM2)暴露在溶液中,其他部位用环氧树脂严格密封。电化学试验都是在CHI600C电化学工作站,在温度为37℃的模拟体液(SBF,NACL8035G,NAHCO30355G,KCL0225G,K2HPO43H2O0231G,MGCL26H2O0311G,CACL20292G,NA2SO40072G,HOCH23CNH26118G)中进行。测量开路电位(OCP)4000S。镁合金的动电位极化曲线测试时电位扫描速度为1MV/S,并且在4000S的开路电位测量之后用小于腐蚀电位(ECORR)的300MV初始电压开始测量。极化曲线测量完成后样品经丙酮、蒸馏水清洗干净后风干。用扫描电子显微镜(ESEM,QUANTA200FEG)进行样品表面腐蚀形貌的观察。之后,将试样浸入含三价铬的溶液(180G/LCRO3)中510分钟,用来清洗表面的腐蚀产物。将清洗风干后的试样再次放在扫描电子显微镜(ESEM)下观察并记录腐蚀形貌。采用KRATOS的AXISULTRA标准分析有X射线光电子能谱采集的数据,X射线光电子能谱仪的射线源为单色ALKΔ225W,15MA,15KV,同时采用低能量的电子流进行电荷补偿。为了消除表面荷电效应的影响,利用C1S谱峰值为28480EV的标准烃进行校准。最后将实验数据转换为VAMAS格式输入CASAXPS软件进行曲线拟合与数据分析。24生物毒性测试小鼠的成纤维细胞(L929)与人体骨肉瘤细胞(MG63)常用于体外细胞培植试验。它们在DULBECCOEAGLE培养液(DMEM)中进行培养,培养液包括10的胎牛血清(FBS)、100UML1青霉素、100UGML1链霉素,在37℃,含5CO2的加湿气氛中试验。常用体外培养液为无血清的DMEM培养液中进行,其表面积与浸提介质比值为1CM2/ML,在37℃、含5CO2的加湿气氛中进行72H的细胞培植,并且经过离心机分离,将上层的清液去除,然后在4℃温度下保存。利用DMEM培养液与含10DMSO的DMEM培养液作为对比试验的阴性对照液和阳性对照液进行细胞毒性试验。细胞培养于96孔的细胞培养板上,每孔附着的细胞与培养液数量比为5103个细胞/100UL,培养24H。去除培养液,每孔加入100UL的提取液,在37℃,含5CO2的加湿气氛中培养的第1、3、5天,用光学显微镜观察96孔培养板各孔的情况,随后在每孔中添加10ULMTT溶液。试样在MTT溶液中继续在37℃,5CO2中培养4H,然后在每孔中添加甲臜溶解液(含每毫升10SDS的HCL)。通过酶标仪(BIORAD680)测定吸光度,采用双波长测定利用波长为570NM和630NM进行测定。并且在不同的时间点进行PH值测定和提取MG、ZN、CA离子进行测定。25细胞黏附测试将200UL细胞悬浮液接种到MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和冷轧纯镁试样(对照)的表面,细胞密度为1105个细胞/ML(L929),5104个细胞(MG63)。分别在37℃,5CO2中的96孔培养板上培养1,3和5天后,在室温下的25戊二醛溶液中浸泡2H,之后用磷酸盐缓冲液(PBS,PH74)冲洗3次。随后在不同梯度的乙醇/蒸馏水(50,60,70,80,90,100)中进行脱水,接着在六甲基二硅胺烷试剂(HMDS)中干燥。对细胞黏附的样品表面用扫描电子显微镜观察并记录形貌特征。并增加不同PH值下的镁合金的对照试验。3、试验结果31微观组织和机械性能图1所示为MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的XRD谱,由图可以发现两种MGZNCA合金具有典型的非晶态花样,其XRD谱没有晶粒体的衍射峰,反而在38和66方向出现明显的散射信号。相对于MG66ZN30CA4试样,MG70ZN25CA5在低角度出现更宽阔的散射峰,其原因可能在于其镁的含量高的缘故,我们都知道镁的原子半径大于锌原子15。图1MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的XRD谱图2所示为MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的曲线DSC(差示扫描量热法)曲线。MG66ZN30CA4的玻璃花温度(TG)和第一个结晶化温度(TX1)都高于MG70ZN25CA5。赵等19,也发现在MGZNCA合金中随着镁的增加,合金的TG与TX1都会下降。图2MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的DSC曲线图3所示为MG66ZN30CA4与MG70ZN25CA5在压缩试验中的典型应力应变曲线。MG66ZN30CA4与MG70ZN25CA5的断裂强度分别为(5658232)MPA和(5312228)MPA,二者都高于铸态纯镁的(198145)MPA20。图3MG66ZN30CA4和MG70ZN25CA5的压缩时应力应变图32电化学行为测量结果图4所示为MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁在模拟体液中的OCP(开路电位)图。两种MGZNCA合金的OCP在开始的1000S时快速增加,而且很明显发现二者都高于铸态纯镁。MG66ZN30CA4试样呈现比MG70ZN25CA5更高的开路电位,其原因可能在于合金中ZN含量不同,由于ZN的电极电位(102VSCE)高于MG的电极电位(165VSCE)9。另外,MG70ZN25CA5和铸态纯镁的开路电位有明显的波动,而MG66ZN30CA4得开路电位要稳定的多。如图4(B)所示,两种MGZNCA合金的阴阳极反应的动态极化电位高于铸态纯镁。随着合金中的ZN的含量增加,会使合金的稳定性增加并降低MG的析氢反应21,22。MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的腐蚀电流密度ICORR分别是353UA/CM2,112UA/CM2和368UA/CM2。通过试验结果可以推断两种MGZNCA合金的腐蚀阻抗比铸态纯镁高,并且MG66ZN30CA4的阻抗高于MG70ZN25CA5。图5所示为浸泡10MIN前后试样的SEM图,MG66ZN30CA4浸泡前后的腐蚀形貌比较类似,而且裂纹很少,然而MG70ZN25CA5和铸态纯镁可以发现很明显很深的裂纹。在去除腐蚀产物后,在MG66ZN30CA4的表面发现很多微观孔洞(210UM),而铸态纯镁会出现更大的不对称分布的孔洞(1060UM)。而XPS试验结果显示MGZNCA合金的腐蚀产物由MG、ZN、CA和O组成,并且在MG66ZN30CA4的表面发现的ZNO和O2含量高于MG70ZN25CA5。33浸泡测试图6所示为铸态纯镁和MGZNCA合金在模拟体液中腐蚀时对溶液PH值的改变。结果显示MG66ZN30CA4对PH值的改变速度慢于铸态纯镁和图4(A)开路电位图(B)MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁的动态电位极化曲线MG70ZN25CA5。并且,铸态纯镁和MG66ZN30CA4在部分区域出现稳定的上升速度。图7所示为MG66ZN30CA4、MG70ZN25CA5和铸态纯镁在模拟体液中不同时间的表面腐蚀形貌图。MG66ZN30CA4试样在37℃的模拟体液中浸泡3天后其表面较为平坦,表面腐蚀产物包含C、O、MG、P、CA、ZN元素,并且ZN的含量比MG还高。在MG70ZN25CA5的表面可以观察到可见的微观孔洞,并且其EDS(能量色散谱)结果显示ZN的含量高于MG,图5AMG66ZN30CA4,BMG70ZN25CA5C铸态纯镁浸泡前的SEM表面腐蚀形貌图和在37℃模拟体液浸泡10MIN后DMG66ZN30CA4,EMG70ZN25CA5F铸态纯镁的SEM表面腐蚀形貌图然而含量的数值没有MG66ZN30CA4高。经过30MIN浸泡后,MG66ZN30CA4试样仍保持原有的几何形状。结果表明MG66ZN30CA4表面的致密均匀的腐蚀产物层中的MG的含量略高于ZN。并且腐蚀产物中的O含量随浸泡时间增长而快速增长。作为对照的铸态纯镁在3天浸泡后表面出现腐蚀裂纹并且腐蚀产物中含有O、MG、P和CA。

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