土壤生态毒理风险评价中的陆生无脊椎生物标志物.doc

-专业文档，值得下载!-专业文档，值得珍藏！-土壤生态毒理风险评价中的陆生无脊椎生物标志物钱芸，刘广良，戴树桂（南开大学环境科学与工程学院，天津300071）摘要：综述了目前土壤生态毒理风险评价中常用的陆生无脊椎生物标志物，并对一些新的生物标志物作了简介，对目前研究的不足及今后需加强领域提出了建议。关键词：土壤；风险评价；生物标志物；无脊椎动物中图分类号：X171.5文献标识码：A文章编号：1008-181X（2002）01-0070-05作为早期预警系统或污染危害的准确测量的有效工具，生物标志物在生态毒理风险评价中得到了广泛的应用。广义上，生物标志物几乎包括所有的反映一个生物系统和潜在危害之间的相互作用的反应测量，这种危害可能是化学的，物理的，或生物的。狭义上，生物标志物指对于某一化学危害的可测量的指标。在生态毒理学文献中，生物标志物一词更进一步指暴露于污染物后生物体中分子的，生物化学的，生理学的，或细胞的改变，包括暴露生物标志物、效应生物标志物、易感性生物标志物三类。近几年对于利用陆生无脊椎动物作为生物标志物评价化合物对土壤生态系统的负效应得到越来越多的重视。陆生无脊椎动物能提供有意义的靶是因为它们在维持土壤生态系统的功能中起着主要的作用，它们能加强土壤的结构并分解有机物质。无脊椎动物代表着土壤中所有动物种类的一个主要成分，并经常以高的种群密度存在，采样作分析后对种群动力学没有显著影响。并且，从伦理学和法律上考虑使用无脊椎动物也比使用脊椎动物合适。与生物标志物有关的是，土壤无脊椎动物具有直接与土壤孔隙水或食物暴露相接触的优越性，而不是象脊椎动物那样，通过食物链间接地暴露。需要指出的是，使用存在于水生（主要是淡水）和陆生生物中的生物标志物时有根本的区别。水生生物标志物多用来在一个动荡环境中为毒性压力提供早期预警。而由于在土壤生态系统中毒性物质的半衰期相对较长（土壤经常作为污染物的汇），故暴露的持续时间也比较长，所以陆生生物标志物对于早期预警来说不是非常必要的。陆生生物标志物的价值在于其直接与土壤中污染物的生物可利用性分数相关，能为土壤的实际危害提供更准确的估计，而不仅仅是测量土壤隔室中总污染物的浓度。生物标志物反应可能是在半致死效应变得明显之前的对于化学压力敏感的指标，例如生长或繁殖的抑制。生物标志物的测定为低于个体水平的环境污染物的暴露和效应的早期评价提供了有力的工具。1常用的陆生无脊椎生物标志物1.1应激蛋白应激蛋白最初是在果蝇中发现的，包括一系列具有不同分子质量的蛋白家族，长期以来被称为“热休克蛋白”（hsp）1。根据其分子质量，应激蛋白可被划分为不同的蛋白家族：不均一的低分子质量的应激蛋白，其分子质量约为1540kDa；线粒体或细胞质的应激-60（hsp60）蛋白（5860kDa）；重要的应激-70蛋白家族（hsp70,6678kDa）；以及应激-90（hsp90，8390kDa）；高分子质量的应激蛋白（100110kDa）。在无脊椎动物中以上蛋白都存在2。此外，一种与非溶酶体蛋白降解有关的的小分子蛋白（7kDa）泛激素，以及另外一种与应激-60相关的约10kDa的蛋白通常也被划入应激蛋白家族中。暴露于多种化合物之后，都能发现应激蛋白的诱导。此类蛋白还对温度升高、损伤、病毒感染以及组织损害有反应3。虽然存在着明显的非特异性，应激蛋白作为暴露和效应生物标志物的适合性得到了越来越多的关注和讨论46。应激蛋白作为生物标志物的主要优势在于它们能将所有的负效应有效地综合并体现在蛋白的完整性上，这可概括为“蛋白毒性（proteotoxicity）”2。而另一方面，应激蛋白水平的普遍提高能指示应激物的存在，但无法提供应激物的化学性质方面的信息4。然而，上述应激蛋白家族成员中的许多种以应激物特异性的方式被调控，这便至少使区分应激物的类型成为钱芸等：土壤生态毒理风险评价中的陆生无脊椎生物标志物71可能5。目前有关应激蛋白作为生物标志物的研究多数集中在脊椎动物，而对于无脊椎动物的应激蛋白作为生物标志物的研究只是在过去几年才得到越来越多的重视，并且是集中在对水生环境的研究上2。但目前对于陆生无脊椎动物中由毒物介导的应激蛋白表达的研究也在增加，并有望建立一套生物分析方法。应激-70是应激蛋白家族中得到最充分研究的一类。使用应激蛋白作为生物标志物的生理学上的合理性即是基于应激-70家族的诱导模式。由于应激-70参与细胞内蛋白的折叠和膜位移7，它对应激蛋白家族在展开及半折叠的多肽链上的结合是必需的。竞争性地与多肽的结合将释放出一种新的与应激-70相关的蛋白，接着新蛋白以磷酸化的三聚物的形式结合到DNA上的热休克元素（hse）区域，从而使应激-70能够得到表达1。因此，当应激物导致细胞中的蛋白变性和畸形增多，从这些蛋白释放出的未折叠的片段或环也增多，由此就加深了上述应激-70诱导过程的破坏8。以实验室对多种重金属混合物对O.Asellus的联合效应的研究为基础，表明升高的应激-70的水平可作为各种不同的现场重金属污染的有效的生物标志物9-10。在实验室试验中，一种土壤线虫C.Elegans的转基因品系被用来评价金属离子（Cd2+，Zn2+，Hg2+，Mn2+，Sn2+，Ag+），林丹，三丁基锡以及受污水体的毒性，此种转基因品系包括一个果蝇的应激-70启动子，启动子结合在EscherichiacolilacZ操纵子基因上11，12。应激-90可以结合在芳香烃（Ah）受体上，因此与细胞色素P-450生物转化系统有密切联系。当暴露于环境压力时，应激-90的合成会增加2。Amaral等13指出，原生动物Tetrahymenapyriformis的应激-90可受到亚砷酸盐诱导，但诱导的特异性机制并不明确。在果蝇中，相当于应激-90的蛋白是hsp83（其染色体位置是63bc）。在果蝇细胞中，hsp83与类固醇激素的基因表达相互作用14。目前已知，hsp90仅作用于参与信号转换的特异的蛋白靶（类固醇激素受体，活化酶，及钙调蛋白）15；因此，可以认为hsp90/83是关于与激素（类固醇）受体相互作用的毒物的特异性生物标志物。线粒体应激-60蛋白的表达也被用作生物标志物的研究。Sanders等16记录了在蚯蚓E.Fetida中由温度升高所致的hsp60诱导。暴露于金属（Zn，Pb，Cd）能导致D.reticulatum,J.Scandinavius，O.Asellus及P.Scaber的应激-60水平轻微升高，但对于金属暴露，此种生物标志物的诱导远不如应激-70敏感9。此外，金属对于hsp60的诱导作为生物标志物，要比金属对生殖作用的EC20敏感得多17。与应激-70和应激-60相比，LMW应激蛋白具有严格的应激诱导2。在研究中，有几种转基因的线虫C.elegans品系被用来接受不同的刺激，这些品系的hsp16基因的启动子与E.ColilacZ操纵子结合18。金属盐类（Cd，Cu，Hg，Mn，Pb，Zn），金属污染的水体，除草剂百草枯，及亚砷酸盐都能激活这些C.Elegans品系的不同器官中的hsp16启动子19，20。1.2金属硫蛋白和其它金属结合蛋白金属硫蛋白（MT）是低分子质量的，富含半胱氨酸，与特定金属离子如锌，铜及镉等有高亲和力的蛋白。研究表明，脊椎动物的MT的合成可被金属、有机化合物或其它应激因素诱导，同时还受到生长和发育等多种内在因素的调节。几年前，在陆生无脊椎动物中发现了金属硫蛋白，并逐渐将其用作生物标志物。但由于MT的结构和功能上存在着种间特异性，目前只是使用已经进行了充分研究的蜗牛物种的MT做生物标志物来评价镉的污染。这些物种是两种有肺动物Helixpomatia和Ariantaarbustorum21。除了陆生腹足纲动物外，还对一些蚯蚓物种如Eiseniafetida体内的MT进行了检测22。目前对这些蛋白由于外部和内部因素引起的诱导潜力尚未有充分研究，它们是否能作为环境中镉污染的生物标志物还有待研究。1.3组织结构和亚显微结构组织和亚显微结构的变化也能作为环境相关的化合物的生物标志物，并能有效评价化合物毒性23。通常使用光学和电子显微镜来诊断由于内部毒性和外部毒性所造成的损害的细胞和亚细胞症状。细胞毒性作为环境诊断的终点受到多种内源和外源参数的影响，例如，营养和发育状况，受试物种的性别，或是环境的湿度24，25。因此，与细胞现状有关的细胞毒性是多种因素的结果，而外来化合物可能的毒性压力是一种非常重要但并非是唯一的因素。对于陆生腹足类Derocerasreticulatum，Arionater和Helixpomatia来说，主要是研究杀软体动物剂和金属(Cd，Hg，Zn)暴露之后其肝胰腺的细胞改72土壤与环境第11卷第1期（2002年2月）变2528。在肝胰腺中，重吸收细胞和嗜碱性细胞表现出最明显的剂量-反应关系，因此被认为是环境污染的监测细胞28。而在蜗牛的皮肤和肠中，粘液变细胞是描述杀软体动物剂压力的合适细胞类型25。Triebskorn等描述了暴露于杀软体动物剂后，蜗牛嗉囊上皮细胞的亚显微结构的变化，这些细胞的上表皮遭到了破坏，脂类储存大量减少，这表明生物在解毒过程中需要更多的能量。在亚细胞水平上，亚显微结构的研究显示，细胞器对污染物有不同的易感性并对污染物有不同的反应范围29。例如，线粒体对多种刺激都较敏感，并能迅速做出整体反应，如肿胀，收缩，脊膜解体，或形成线粒体内结晶30。这些变化通常是毒物与膜成分之间整体作用及线粒体膜上离子传输发生改变的结果31。粗糙和平滑内质网在中毒之后也能迅速做出反应，与线粒体相比，内质网反应的各个阶段有比较明显的界限，比较容易区分其早期及进一步的细胞反应。内质网反应包括肿胀，脱粒，囊泡化，形成同心排列的涡旋囊腔等，这些反应与机能的改变如生物转化氧化酶的诱导，及重组细胞整合的膜蛋白的表达或甘露糖醇氧化酶的存在有关。对于不同类型的刺激，细胞核会迅速或延迟地产生不同症状，如核质变暗或增亮，核膜肿胀，在核质中产生特殊内含物（如液体），染色质凝结，或核溶解30，32。这些变化可能是由毒物与染色质的结合导致的，也可能与膜的改变或一切能导致细胞死亡的代谢改变有关32。总之，细胞对于不同环境因素的反应能体现细胞的代谢状态，而各种外来物又以不同的方式影响着细胞代谢。因此，应采用构成中毒反应综合症状的细胞器的总体反应而非单个细胞器的单个反应来作为解释压力因子在细胞水平上产生的影响的生物标志物。1.4同工酶同工酶是能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们由两个或两个以上亚基聚合而成，酶蛋白之间的生理性质、理化性质及作用性质都不相同，分子的立体空间构象也存在差异。在此方面主要是研究重金属和农药对同工酶活性的效应。各种农药对乙酰胆碱酯酶的效应的研究由来已久。毒扁豆碱是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，并可用来鉴别这种特异性的酶。并不是所有的无脊椎动物都含有对毒扁豆碱敏感的酯酶。例如在德国蟑螂（Blatellagermanica）体内就未检测到乙酰胆碱酯酶，但它含有胆碱酯酶，当暴露于农药Chlorpyrifos,propoxur,cypermethrin，其体内的胆碱酯酶活性升高。而棉蚜虫（Aphisgossypii）则含有羧酸酯酶，并对农药做出反应，使其对农药产生抗性。有些物种的酯酶对农药（malathion）和毒扁豆碱的反应具有性别差异，如Anophelesstephensi33。由于不同的基因型对毒物刺激可能会产生不同的反应，因此在风险评价中，常联用同工酶凝胶电泳和酶活性检测的方法33。1.5溶酶体膜的完整性在亚细胞水平上，溶酶体系统是外来物毒性效应的特殊靶位点。溶酶体是一组形态不同的含酸性水解酶的膜结合亚细胞器，其直径范围为25nm到1m。细胞中的溶酶体起着分解细胞器和高分子物质的作用。在稳定的溶酶体中，完整的溶酶体膜可以防止水解酶与底物发生反应。当受到刺激时，膜的渗透性增高，稳定性降低。对于很多生物来说，溶酶体的生理变化对于鉴别外来物的负效应十分有用。目前常用的受试生物为蚯蚓，检测其暴露于无机和有机污染物后，体腔细胞溶酶体膜渗透性的变化。检测方法为中性红分析法34。健康的溶酶体能吸收并长时间地保留染料中性红，具有较长的中性红保留时间（NRRT,neutralredretentiontime）；而当生物受到刺激后，由于溶酶体膜渗透性增大，溶酶体所吸收的中性红会逐渐渗出溶酶体膜，进入周围体液中。这一方法能在实验室和现场研究中对多种有机和无机污染物作出定量分析35，36。由于这一反应对有机和无机污染物的反应是相同的，因此是非特异性的。和免疫活性指标相结合，蚯蚓体腔溶酶体活性也可用来指示重金属的免疫毒性37。由于各种非化学刺激，如组织缺氧，高热，渗透过度及食物缺损都可能诱导溶酶体反应，因此这一反应是非特异性的，可作为动物健康及其环境退化的总体指标。2新的生物标志物由于目前研究的生物标志物多数是（毒性）压力的整体指标，因此需要进一步研究新的生物标志物，从而更好地阐释生物标志物活性和暴露之间的关系。核磁共振谱（NMR）是用来探索新生物标志物的有效方法。此外，还发展了如HPLC-NMR-MS(高效液相色谱核磁共振谱质谱)等联用技术。而生钱芸等：土壤生态毒理风险评价中的陆生无脊椎生物标志物73物核磁共振谱能够揭示并检测多种复杂的生物相（如生物体液，组织浸出物及活组织）中所发生的生物化学过程，因而受到了更多的关注。高分辨率的质子NMR具有许多适合于代谢和毒理学研究的特征（如快速，特异性，非选择性，不破坏研究对象），因此被用来作为一种生物医学探针，检测小样本的生物体液或组织萃取物中的低分子质量化合物。Gibb等38应用高分辨率质子NMR研究了各种不同的实验室和野外暴露条件下，铜（II）对两种蚯蚓（Eiseniaandrei,Lumbricusrubellus）的生化效应。此外，在生态毒理学的研究中，还发展了NMR模式识别（NMR-PR）技术，用以研究代谢的大致轮廓。3目前研究的不足由于土壤环境组成复杂，含水量、酸碱度、温度、湿度等理化性质经常有较大的波动，而用作生物标志物的生化指标受这些因素的影响很大。同时，不同的污染物对这些指标也经常表现出相似的毒性效应。因此，有关选择更加灵敏特异的生物标志物，区分环境因素和污染物的效应以及各种不同污染物的效应的研究极待加强。目前使用的生物标志物多为个体效应生物标志物，这些生物标志物与更高层次上（种群、群落甚至生态系统）的生物的健康状况尚缺乏直接的联系。探求个体生理生化上的受损与种群数量或整个生态系统的健康状况之间的联系，或者选择可代表区域环境物种健康状况的非个体水平的生物标志物用于生态风险评价，也是需要加强的领域。参考文献：1GETHINGMJ，SAMBROOKJ.ProteinfoldinginthecellJNature,1992,355:33-45.2SANDERSBM.Stressproteinsinaquaticorganisms:anenvironmentalperspectiveJ,CritRevToxicol,1993,23:49-75.3SANDERSBM,DYERSD.CellularstressresponseJ.EnvironToxicolChem,1994,13:1209-1210.4SCHLESINGER.Stressproteins.InductionandfunctionM.NewYork:Springer-Verlag,1990.5PEAKALLDB,WALKERCH.Theroleofbiomarkersinenvironmentalassessment:(3)VertebratesJ.Ecotoxicology,1994,3:173-179.6DEPOMERAIDI.Heat-shockproteinsasbiomarkersofpollutionJ.Hum.ExpToxicol,1996,15:279-285.7PELHAMHRB.SpeculationsonthefunctionofthemajorheatshockandglucoseregulatedproteinsJ.Cell,1986,46:959-961.8CRAIGEA,GROSSCA.Ishsp70thecellularthermometer?J.TrendsBiolSci,1991,16:135-140.9ECKWERTH.Theinductionofstressproteins(hsp)inOniscusasellus(Isopoda)asamolecularmarkerofmultipleheavymetalexposure:I.PrinciplesandtoxicologicalassessmentJ.Ecotoxicology,1997,6:249-262.10KÖHLERHR,ECKWERTH.Theinductionofstressproteins(hsp)inOniscusasellus(Isopoda)asamolecularmarkerofmultipleheavymetalexposure:II.JointtoxicityandtransfertofieldsituationsJ.Ecotoxicology,1997,6:263-274.11GUVENK.Evaluationofastress-inducibletransgenicnematodestrainforrapidaquatictoxicitytestingJ.AquatToxicol,1994,29:119-137.12MUTWAKILMHAZ.Useofstress-inducibletransgenicnematodesasbiomarkersofheavymetalpollutioninwatersamplesfromanEnglishriversystemJ.ArchEnvironContamToxicol,1997,32:146-153.13AMARALMD.StressresponseofTetrahymenapyriformistoarseniteandheat-shock:differenceandsimilaritiesJ.EurJBiochem,1988,171:145-160.14PLESOFSKY-VIGN.TheheatshockproteinsandstressresponseA.In:MarzlufB,ed.TheMycota,vol.IIIC.Springer-Verlag,171-190,1996.15CRAIGEA.Heatshockproteinsandmolecularchaperones:mediatorsofproteinconformationandturnoverinthecellJ.Cell,1994,78:365-372.16SANDERSBM.Specificcross-reactivityofantibodiesraisedagainsttwomajorstressproteins,stress70andchaperonin60indiversespeciesJ.EnvironToxicolChem,1994,13:1241-1249.17KAMMENGAJE.HSP60asapotentialbiomarkeroftoxicstressinthenematodePlectusacuminatusJ.ArchEnvironContamToxicol,1998,34:253-258.18STRINGHAMEG,CANDIDOEPM.Transgenichsp16-lacZstrainsofthesoilnematodeCaenorhabditiselegansasbiologicalmonitorsofenvironmentalstressJ.EnvironToxicolChem,1994,13:1211-1220.19STRINGHAMEG,CANDIDOEPM.Targetedsingle-cellinductionofgeneproductsinCaenorhabditiselegans:anewtoolfordevelopmentalstudiesJ.JExpZool,1993,266:223-227.20DENNISJL.Effectsofmetalionsincombinationwithanon-ionicsurfactantonstressresponsesinatransgenicnematodeJ.AquatToxicol,1997,40:37-50.21BERGERB,DALLINGERR.TerrestrialsnailsasquantitativeindicatorsofenvironmentalmetalpollutionJ.EnvironMonitAssess,1993,25:65-84.22SUZUKIKT.Cadmium-bindingproteinsinducedintheearthwormJ.ArchEnvironContamToxicol,1980,9:415-424.23TRIEBSKORNR.Inductionofheatshockproteins,changesinliverultrastructure,andalterationsoffishbehavior:arethesebiomarkersrelatedandaretheyusefultoreflectthestateofpollutioninthefield?J.JAquatEcosystStressRecov,1997,6:57-73.