毕业设计（论文）-松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定

本科毕业论文（设计）2015届题目松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定（纸层析法）测定层析法学院生命与环境科学学院专业生物科学学生姓名学号指导教师职称（学位）研究员合作导师职称（学位）完成时间2015年月日成绩综合成绩等级黄山学院教务处制黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第II页共13页学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）2015年月日黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第III页共13页目录摘要英文摘要1引言111松萝茶简介112松萝茶有机茶园地理环境113茶氨酸特性12材料和方法221仪器与试剂222材料322方法323实验前准备3231试剂配制3232实验样品处理324层析3241准备层析纸3242层析步骤425数据处理43结果4313、12、15号基地地理位置432茶氨酸标准溶液数据及标准曲线533松萝茶鲜叶茶氨酸含量534不同基地松萝茶鲜叶中茶氨酸占干重的比值64讨论741纸层析发的优点及不足742松萝茶中茶氨酸含量7参考文献8致谢8黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第IV页共13页松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定层析法刘峰21109041029导师吴卫国（研究员）（黄山学院生命与环境科学学院）摘要本文采用纸层析法对采自安徽省休宁县境内3、12、15号松萝茶基地的松萝茶进行鲜叶的茶氨酸含量测定分析。结果表明，3、12、15号基地的松萝茶鲜叶茶氨酸含量占干茶的135297，而不同地理位置的松萝茶中茶氨酸含量有一定的差异性。关键词松萝茶；茶氨酸；纸层析法THECOMPARATIVESTUDYOFTHEANINEINTEAFROMBASE3,BASE12ANDBASE15ORGANICSONGLUOTEAGARDENPAPERCHROMATOGRAPHYFENGLIU21109041029SUPERVISORWEIGOUWURESEARCHFELLOWCOLLEGEOFLIFEANDENVIRONMENTSCIENCES,HUANGSHANUNIVERSITY,HUANGSHAN,245041CHINAABSTRACTINTHISSTUDY,THECONTENTOFTHEANINEINSONGLUOTEAHASBEENANALYZEDBYPAPERCHROMATOGRAPHYINBASE3,BASE12ANDBASE15ORGANICTEAGARDENFROMXIUNINGCOUNTYOFANHUIPROVINCETHERESULTSINDICATEDTHATTHEFRESHCONTENTOFTHOSETWOKINDSSONGLUOTEAOCCUPIED135297OFDRYTEASTHECONTENTOFTHEANINEINSONGLUOTEAWEREDIFFERENTWHERETHESONGLUOTEAWEREGROWNINTHEDIFFERENCEGEOGRAPHICALPOSITIONKEYWORDSONGLUOTEATHEANINEPAPERCHROMATOGRAP黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第1页共13页1引言11松萝茶简介松萝茶属绿茶类，为历史名茶，创于明初。松萝茶因山名而得茶名，产于黄山市休宁县境内的松萝山，属黄山余脉。松萝茶的采制技术，早在四五百年前已达到精湛娴熟的程度，它具有色绿、香高、味浓等特点。松萝山也被誉为中国炒青茶发祥地。2012年1月，国家质检总局批准对松萝茶实施地理标志产品保护。松萝茶的品质特点是条索紧卷匀壮、叶张肥嫩，呈波纹隆起，叶背遍布洁白茸毛色泽绿润；汤色绿明、香气高爽、滋味浓厚，带有橄榄香味。饮后令人神驰心怡，古人有“松萝香气盖龙井”之赞辞。松萝茶含有较多的营养成分和药效成分，每百克松萝茶中，维生素C的含量达170毫克，果胶316；碳水化合物392，咖啡碱405；多酚类2739，此外还含有丰富的亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等17种氨基酸，以及矿物元素等有机化合物，人称“绿色之金子”。有抗癌症，抗衰老，助消化，利尿，防辐射，减肥，提神，解渴的作用。12松萝茶有机茶园地理环境松萝茶有机茶园位于安徽休宁城北约15公里的松萝山，松萝山与琅源山、天宝山、金佛山相望，最高峰海拔882米，茶园多分布在海拔600700米之间，山势险峻，崖悬壁峭，松萝交映，连绵数里，风景秀丽，“松萝雪齐”为休宁海阳八景之一。山上气候温和，常年云雾弥漫，雨量充沛，土壤肥沃，土层深厚。得天独厚的小气候环境和含有银元素的乌砂土质为培植品质优良的名茶创造了特定的条件。13茶氨酸特性1949年，日本学者酒户弥二郎首次发现并提取茶叶中的茶氨酸。茶叶中的茶氨酸属酰胺类化合物，易溶于水，性质稳定，本身有焦糖的香味及鲜爽味（味阈值为006）（帅玉英，2008）。此后有研究证明，茶氨酸是茶叶中的主要呈味物，其含量与绿茶的品质呈正相关（李炎，1998）。氨基酸是具有氨基和羧基的有机化合物，是组成蛋白质的基本单位，它参与生物体内的新陈代谢和生理过程。茶叶中的氨基酸，不仅是决定茶汤滋味的主要成分，而且与茶叶的品质有一定的相关性。茶叶中的氨基酸超过25种，黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第2页共13页茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主体部分，不同等级和不同品种的茶叶，茶氨酸都占茶叶游离氨基酸的50以上，约占茶叶干重的12。它是1950年由日本学者酒户弥二郎从绿茶中分离并命名的，属酰胺类化合物N乙基R谷氨酰胺，极易溶于水，具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味，对绿茶滋味具有重要作用李银花等，2005。茶氨酸还能缓解茶的苦涩味，并增强其甜味，是茶叶品质的重要评价因子之一（朱小兰等，2003）。文献中关于茶氨酸测定的研究统计显示，茶氨酸的测定方法包括电化学分析法、纸层析和薄层色谱法、气相色谱法、离子交换色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等。高效液相色谱法是目前使用较多的一种氨基酸分析方法。1986年，朱衍报道采用高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸。在一定条件下用纯品茶氨酸作标准曲线，在线性范围内，根据峰高或峰面积即可换算出茶叶中茶氨酸的含量。朱小兰等（2003）建立了一种非衍生化高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸含量的方法。采用的色谱条件为C18柱，以005三氟乙酸水溶液为流动相，流速10ML/MIN，进样量10L，检测波长203NM，同时以高效液相色谱电喷雾离子化质谱对所分离的茶氨酸进行了纯度鉴定（谭和平等，2007）。茶叶中的多酚类及其衍生物、氨基酸、维生素、咖啡碱等成分对松萝茶的风味、品质及其功效有较明显的影响。其中，又以茶叶中的特征氨基酸茶氨酸关系最为密切。在已发现的30多种氨基酸中，以茶氨酸的含量最高，约占到茶叶中游离氨基酸的总量的50以上（吕毅，2003）。本文以安徽休宁县不同地理位置的松萝茶基地的松萝茶为研究对象，采用纸层析法进行茶氨酸的检测分析，旨在筛选出高茶氨酸品种，同时对不同区域间茶氨酸含量进行分析，了解不同区域间松萝茶的茶氨酸含量差异，提取茶氨酸生物源提供依据。2材料与方法21仪器与试剂（1）仪器分析天平AB204N梅特勒一托利多仪器上海有限公司、分光光度计721型,上海第三仪器分析厂、电热恒温水浴锅HHS216V型,上海医疗器械五厂、电热恒温干燥箱SZ2021型,浙江诸暨电热仪器厂、4000R/MIN离心机、GPS、冰箱、吹风机。（2）试剂L茶氨酸含量99上海源聚生物科技有限公司,L谷氨酸上海展云化工有限公司，分析纯无水乙醇,水合茚三酮950，氯化亚锡，蒸馏水。黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第3页共13页22材料松萝有机茶园3、12、15号基地的松萝茶鲜叶，采摘标准为一芽两叶。23实验前准备231试剂配制茶氨酸标准溶液（1ML含茶氨酸01MG）准确称取100MGL茶氨酸，溶于100ML水中，充分溶解后，准确吸取5ML母液，加蒸馏水稀释十倍得到茶氨酸标准溶液。展层剂精确量取无水乙醇75ML，加蒸馏水定容至100ML，取10ML2茚三酮溶液，用75的乙醇定容至100ML得到展层剂。2茚三酮准确称量02000G的水合茚三酮，加入5ML蒸馏水使其充分溶解。随后加入0008G氯化亚锡，用玻璃棒搅拌均匀，放在暗处，静置24小时后过滤定容至10ML。最后将其存于棕色容量瓶，放置在低温暗处保存。洗脱剂精确量取无水乙醇60ML，加蒸馏水定容至100ML，即得到60的乙醇洗脱剂。232实验样品处理鲜叶预处理将装有鲜叶的烧杯放入60电热恒温干燥箱中烘干，直至恒重。将烘干后的茶叶研磨至粉末状，装袋密封后放入冰箱冷藏。样品浸提精确称取1G（精确度为00001G）茶叶粉末于烧杯中，加蒸馏水60ML，将烧杯置于100恒温水浴锅中浸提45分钟，期间每10分钟摇晃搅拌一次。水浴充分后，待其冷却至常温，4000R/MIN离心5MIN。将上清液过滤，并定容至100ML，混匀后放入冰箱冷藏。24层析241准备层析纸将层析滤纸剪裁成20CM20CM大小，在距层析纸下沿15CM处画一横线，每隔2CM做一标记，分别编号为1、2、3、4、5、6，标记处即点样处。从横线开始向上15CM处画一横线，作为层析停止标记。将直径15CM的培养皿放在平铺的保鲜膜上，加入50ML的展层剂，将2000ML的烧杯倒置于培养皿上方，用保鲜膜密封，保持水平。黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第4页共13页242层析步骤点样用20UL毛细滴管吸取茶氨酸标准溶液在标记处进行点样，每点一次即用吹风机吹干，待完全干燥后再继续点样。重复操作。吹风机温度不宜过高，每滴样液直径在05CM以内。在16标记处点样品20UL、30UL、40UL、50UL、60UL、70UL。干燥点样完成后，待其完全干燥后，将层析纸沿横线弯曲用棉线连接（两条边勿接触）卷成筒状，将滤纸垂直放入装有层析液的培养皿中，扣上烧杯，立即密封好。展层等展层剂渗入到停止标记处，约3H后，取出层析完成后的层析滤纸，挂在60恒温干燥箱干燥10MIN。干燥后，取出观察层析情况烘干后的层析纸上以茶氨酸的显色带最为明显。水浴将茶氨酸的显色带以15CM15CM正方形规格裁下，将其剪碎后放入试管，随后依次加入5ML洗脱剂，并立马盖上塞子（防止洗脱剂挥发），摇匀后放入40的水浴锅中20MIN。水浴后取出试管冷却至常温，待测。测定在已预热好的722N分光光度计570NM处，以空白对照为参照物，依次测出样品的吸光值。25数据处理所有数据处理均运用MICROSOFTEXCEL2007统计软件进行数据分析。3结果313、12、15号基地地理位置3号基地位于山上有机茶园内，12号基地位于山边公路旁，15号基地位于山上，经纬度及海拔见表31。表313、12、15号基地经纬度及海拔松萝茶基地3号12号15号经度11852911852781188402纬度300362957642953414海拔（M）300277298黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第5页共13页32茶氨酸标准溶液数据及标准曲线对茶氨酸标准溶液进行纸层析，测定以茶氨酸标样的吸光度值（表32），以测得的茶氨酸标样吸光度值对质量做出茶氨酸的标准曲线，得到线性方程，如图31。表32茶氨酸标准溶液纸层析OD值体积/UL203040506070质量（MG）000200030004000500060007OD值000700180025003400460061注横坐标X为OD值，纵坐标Y为标液体积。图31茶氨酸标准曲线33松萝茶鲜叶茶氨酸含量实验所用松萝茶样液均为现配现用，且与茶氨酸标准液是在同一时间同一地点进行。将松萝茶3、12、15号基地松萝茶样液分别上述的步骤进行实验，得到松萝茶鲜叶的吸光值，如表33、34、35所示。表333号基地松萝茶茶氨酸含量点样量UL203040506070OD值001300001800002500003000003300004000茶氨酸质量000271000319000385000433000461000528黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第6页共13页（MG）注点样量单位UL，吸光度单位MAU，茶氨酸量单位MG。表3412号基地松萝茶茶氨酸含量点样量UL203040506070OD值001300001800002300002600003300003700茶氨酸质量（MG）000271000319000366000395000461000499注点样量单位UL，吸光度单位MAU，茶氨酸量单位MG。表3515号基地松萝茶茶氨酸含量点样量UL203040506070OD值001400002100002500003400003800004700茶氨酸质量（MG）000281000347000385000471000509000594注点样量单位UL，吸光度单位MAU，茶氨酸量单位MG。34不同基地松萝茶鲜叶中茶氨酸占干重的比值松萝茶茶氨酸含量的比较注横坐标X为点样量，纵坐标Y为茶氨酸量。图323、12、15号基地松萝茶茶氨酸含量松萝茶茶氨酸占干重比值的比较表353、12、15号基地松萝茶中茶氨酸占干重的比值点样量2030405060703号茶氨酸占比00135560015930019300216300230540026379黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第7页共13页12号茶氨酸占比0014030017355001930023530025429002970315号茶氨酸占比00135560015930018300197300230540024954注横坐标X为点样量，纵坐标Y为茶氨酸量占干重比值。图333、12、15号基地松萝茶茶氨酸含量占干重比值4讨论41纸层析发的优点及不足本实验采用纸层析分离茶样中氨基酸,和茚三酮反应后用分光光度计比色直接测定茶氨酸含量。由于仅仅包含最终显色时候的一个化学反应,整个过程步骤单纯,只需要乙醇、茶氨酸、茚三酮等3种化学药品,因而操作简单,容易控制。此外,茚三酮与氨基酸显色在较长时间内保持稳定,可实现多个样品的同时分析,真正满足普通实验室对茶氨酸测定的需要。然而,本方法灵敏度不够强,不适合茶氨酸含量较低样品的测定。此外,在纸层析分离时,需要将2070L水溶液不断点到滤纸上的一个点上,吹干,花费时间较长。本实验中茶氨酸在层析纸上的条带有明显的拖尾现象。造成这些结果的原因有以下几点实验重复次数不够、点样过程中某些样点的半径过大、使用吹风机型号不同导致风速温度等不同、个别样液未完全干燥便继续点样等。42松萝茶中茶氨酸含量本实验中采用的材料为采自安徽省休宁县境内的3、12、15号基地松萝茶基地内的松萝茶，属于休宁本地种。茶氨酸主要是谷氨酸和乙胺在根中合成，黄山学院生命与环境科学学院学士学位论文第8页共13页根部合成的大部分茶氨酸通过树干运送到芽尖贮藏，在日照下转化为儿茶素（赵丹等，2002），3个基地处于同一地点的不同海拔，实验结果有所不同，即12号基地位于山边公路旁，海拔较低，茶氨酸含量较高，而3号、15号基地位于山上，海拔几乎等高。且均较高，茶氨酸含量较低。结果表明茶氨酸含量可能跟高度、日照等外在因素有关，有待进一步进行对比实验证明。参考文献李银花，刘仲华，黄建安，等高效液相色谱蒸发光散射检测器测定茶叶中茶氨酸茶叶科学，2005，252225228朱小兰，陈波，等高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸色谱，2003，214400402吕毅，郭雯飞，倪捷儿，杨贤强茶氨酸的生理作用及合成茶叶科学，2003，0115帅玉英，张涛，江波，沐万孟茶氨酸的研究进展食品与发酵工业，2008，11117123李炎，陈昕茶氨酸合成与应用广州食品工业科技，1998，032326赵丹，王朝旭茶氨酸的国内外研究现状食品科学，2002，05145147张健，荣绍丰，龚钢明，邱子春不同茶叶中茶氨酸含量的测定比较食品科学，2008，04335337岳婕，李丹，杨春，马蕊，奉展英，罗军武不同茶树品种氨基酸组分及含量分析湖南农业科学，2010，23141143王小雪，邱隽，宋宇，王朝旭，孙长颢茶氨酸的抗疲劳作用研究中国公