神经干细胞研究进展

,神经干细胞研究进展,报告内容提要国内外研究现状骨髓源神经干细胞的横向分化骨髓源神经干细胞致瘤性研究骨髓源神经干细胞的活体示踪,一、国内外研究现状,神经干细胞的概念,神经干细胞是指来源于神经组织及神经组织的发源地、终生保持自我更新能力，并能分化为各种神经组织细胞的一类细胞称为神经干细胞。,神经干细胞的研究概述,1989，Tamir等由造血干细胞引申出神经干细胞的概念 Reynolds BA（1992 Science）正式提出神经干细胞的概念 90年代以后，国内外兴起了神经干细胞的研究热潮,神经干细胞的来源,胚胎源性神经干细胞 （早期胚胎 胚胎神经组织） 成体源性神经干细胞 神经组织 非神经组织（骨髓、脂肪、皮肤等）,神经干细胞种子细胞来源,妊娠3个月,1.胚胎,终止妊娠，取胎脑,分离获取神经干细胞,孵化培养,移植,存在的问题伦理免疫排斥细胞数量少,2.克隆,卵细胞,卵细胞吸除核+精细胞DNA,电或化学刺激,形成胚胎妊娠3个月,终止妊娠,取胎脑获取干细胞,移植,存在问题,存在的问题伦理问题基因缺失 或突变,3.自身成体干细胞,骨髓（室管膜、脂肪）,诱导分化传代增殖,神经干细胞,移 植,优 点骨髓来源丰富、获 取容易不存在伦理问题不存在免疫排斥问题 困 难 定向诱导分化难度大,4.髓鞘移植,获取胚胎嗅鞘细胞,培养传代增殖,髓鞘细胞,移 植,存在问题仅适用脱髓鞘疾病伦理问题免疫排斥细胞数量少,二、骨髓源神经干细胞的横向分化,雌性SD大鼠,阴道脱落细胞涂片 排卵期,合笼,三种实验材料,0.5天胚鼠（精子+）,10.5-14.5日胚鼠（作对照）,大鼠、猫、家犬骨髓,雄性大鼠,骨髓穿刺,恒河猴 / 成人骨髓,（1）,（2）,（3）,主要移植过程,动物神经干细胞BrdU或GPF标记）,动物/人神经干细胞,离心，细胞悬浮于 0.85% 生理盐水中,经立体定向或静脉或脑室注射，移植到模型动物或病员体内,观察动物切片人PET等,a,b,a 原代培养24h。 Nestin 阳性的细胞克隆形成（箭头） b 传代培养48h。细胞再次形成克隆（箭头）,a,b,a 形成的神经干细胞克隆球b 有神经元/神经胶质细胞样长突起细胞分化,图1. 在苏木素预染背景下由神经球传代培养后的Nestin阳性细胞（）。而已分化的细胞则呈Nestin阳性（）(400X) 图2. 在有血清条件下传代培养3周的NSE阳性细胞 (400X) 图3. 在有血清条件下传代培养3周的GFAP阳性细胞 (400X) 图4. 在无血清传代培养中的Nestin阳性神经球(400X),NESTIN免疫磁珠法分离大鼠神经干细胞（箭头）,丫啶橙荧光染色鉴定大鼠神经干细胞及分化细胞活力情况（a,b）.NESTIN免疫磁珠标记的大鼠神经干细胞（c）。,a,b,c,NSCs提纯后流式细胞仪检测结果。a 同型对照；b 阳性Result of flow cytometry at post-purification . a Immunomagnetic beads-free; b With immunomagnetic beads,大鼠NSCs提纯后检测神经干细胞BF-1(脑因子) 、部分分化早期细胞 GABA（氨基丁酸）和TH（酪氨酸羟化酶）总RNA表达,7 6 5 M 4 3 2 1,880 bp 600 bp 460 bp 350 bp100 bp,THGABABF-1,大鼠NSCs提纯后RT-PCR法鉴定神经干细胞不同蛋白表达。 1:BF-1 ；2:TH ；3:GABA ； M：分子量标记； Control:PBS对照,7 6 5 M 4 3 2 1,M 1 2 Control,100 bp350 bp460 bp520bp600 bp880 bp,3,a,b,c,d,大鼠骨髓基质细胞。0h（a）；13h（b）；39.5h（c）. 培养70h（d），将细胞球分离成单细胞再种植于滋养细胞层（空箭头），有典型的神经元样长突起细胞形成（黑箭头）。,大鼠骨髓基质细胞。 a 细胞增殖情况 (48h, 100) b 细胞分化情况（17d, 200） c 分化细胞形态（24d, 400）,a,b,c,猫骨髓基质细胞。9天（a，400）；18天（b， 400 ）; 1周（c ， 400 ）；4周(d ， 100 )源于骨髓的神经干细胞发育成大圆细胞，并可见到处于分裂中及分化后的细胞。,a,b,c,d,家犬骨髓源性神经干细胞分化而来典型的神经元样细胞。（ 400 ）,家犬骨髓源性神经干细胞。扩增72h，克隆形成（ 200）,恒河猴的捕捉、麻醉、骨髓获取。,恒河猴骨髓源性NSCs。 a 纯化后MSCs光镜下 形态（1d, 200 ）b 增殖后形成的岛屿状细胞团（7d, 200）c 分化后细胞光镜下的形态（24d，100）,a,b,c,a,b,c,d,恒河猴骨髓源性神经干细胞分化为典型的神经元样细胞,恒河猴骨髓源性NSCs。 a Nestin染色 （10天，DAB显色，200） b 分化后表达NSE抗原阳性的细胞 （ 20天， DAB显色，200） c 分化后表达GFAP抗原阳性的细胞 （ 18天，DAB 显色，200）,a,b,c,a 手术切口 b MPTP缓慢注入颈内动脉,a,b,模型制作后w, PET（放射显影剂为1- 18F 氟代- 2-脱氧葡萄糖, 2-18FFDG）检查结果.上图为轴位，下图为冠状位，每图左侧为模型侧，右侧为对照侧，可见模型侧基底节区放射性浓聚明显少于对照侧,模型动物代谢改变（PET检查）,PET检查模型动物代谢改变（a,b 冠状切；c,d 水平切）,a 造模后10w, 对模型动物进行灌注 bcd：恒河猴大脑 e：恒河猴脑干,a,b,c,d,e,再固定后冰冻切片,双侧黑质中线两侧DAB染色对比. 左图为正常侧，右图为模型侧（造模后10w, 40),对照侧 模型侧中脑切片DAB染色显示双侧红核（造模后10w, 40）,a 恒河猴中脑切片对照侧黑质TH染色, 改良SABC法 （造模后10w, 200,）b 恒河猴PD模型侧TH染色，改良SABC法 （造模后10w, 200）,a,b,T7,P CMV CMV,BGH PA,ITR,Amp,r,polyA,CoiE1,SV40,ITR,SV40AP,Neomycin,SP6,EcoR I EcoR I,CMV,ITR,polyA,Amp,r,ITR,Construction of pWAV2-TH,pcDNA3,-TH,pWAV2,Kpn I,EcoR I,Sma I,Sal I,Bgl II,Hind III,Kpn I,BamH I,BstX I,TH,EcoR I,EcoR V,BstX I,Not I,Xho I,Xba I,Apa I,f1ori,pWAV2,-TH,Kpn I,TH,EcoR I,Sma I,Sal I,Bgl II,Amp,r,TH基因载体构建,转TH基因免疫细胞化学检测（为NSC转基因移植治疗奠定基础）,体外Brdu标记阳性的恒河猴骨髓源性神经干细胞(10d, 200),源于人骨髓基质细胞的神经干细胞，移植前以rAAV-GFP 标记的细胞状态,a,b,c,d,e,f,假伤组1424h脑片(未见BrdU+细胞, 400),模型常规治疗组1424h 脑片(偶见BrdU+细胞, 400),关于移植后NSC 出现时间的初步探索（家犬）,干细胞经脑室治疗组：伤后第1424h伤区BrdU+细胞， 400,干细胞经血管内治疗组：伤后第1424h中脑伤区BrdU+细胞, 400,家犬骨髓源性神经干细胞经BrdU+标记后移植至损伤脑内（400 ） 关于NSC移植途径的初步探索（家犬）,人骨髓源性神经干细胞。陈某，男，38岁. 神经干细胞克隆球形成，并有长突起细胞分化。,a: 0h b: 7d c:10d d:12d,a,b,c,d,人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（）,人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（）,a,b,c,d,人骨髓源性神经干细胞。李某，男，45岁.由源于骨髓基质细胞的神经干细胞球分化出神经元样长突起细胞。 14d （a、b），17d（c、d）.,a,b,人骨髓源性神经干细胞。何某，女性，22岁. 源于骨髓基质细胞的神经干细胞克隆球及其分化的神经元样长突起细胞。原代培养12d（a ） ， 18d（b ）。,人骨髓源性神经干细胞。张某，女，42岁d. 骨髓基质细胞 原代培养 8 天（a,b），细胞发育更大、更圆，颗粒明显。培养 10天d (c,d)，具有长突起的神经元样细胞分化形成，突起间有连接。,a,b,c,d,a,b,c,人骨髓源性神经干细胞。朱某，男，27岁。分化前的干细胞阶段（a, 12天）及分化后形成典型的神经元样长突起细胞(b，20-30天 )。,a,b,源于人骨髓神经干细胞的长突起细胞免疫细胞化学方法鉴定。 a NSE阳性. 双极神经元.b GFAP-阳性，神经胶质细胞。.,氨基酸标准品混合液4.183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸,RA因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞,天冬氨酸,氨基酸标准品混合液4.183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸,Lif因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞,谷氨酸,纯培养基空白对照,肝脏细胞阴性对照,源于人骨髓基质细胞的神经干细胞，移植前状态。,a,b,c,d,20%,30%,40%,10%,骨髓源性神经干细胞移植手术中。(神经干细胞准备),手术显微镜检测下进行神经干细胞移植。,伤后个月运动性失语神经干细胞移植术,术前,术后（6个月）,术前,术后（4个月）,C3-6损伤3个月病员，神经干细胞移植术,三、骨髓源神经干细胞致瘤性研究,U251细胞豆球蛋白A（ConA）凝集试验（ConA:100g/ml），显示U251肿瘤细胞有明显的凝集反应，细胞表面结构发生改变。光镜100,骨髓源性NSC豆球蛋白A（ConA）凝集试验（ConA:100g/ml），显示骨髓源性NSC无明显的凝集反应。光镜200,神经干细胞的致瘤性研究,体外培养10天的骨髓源性NSC的染色体带核型分析，显示为正常核型（46，XY），未见染色体数目异常和畸变。表明经体外培养的骨髓源性NSC保持了正常的遗传学特性。,U251细胞在软琼脂中培养18天，可见明显的细胞克隆形成，表明其不具有停泊依赖性，呈现恶性细胞的表现。光镜200,体外培养的骨髓源性NSCs在软琼脂中培养18天，未见细胞克隆形成，表明其具有停泊依赖性，为正常细胞的特征。光镜400,U251细胞接种裸鼠两个月，于接种部位可见明显的肿瘤组织形成,骨髓源性NSCs接种裸鼠四个月后，接种部位未见有异常组织形成，表明体外培养的骨髓源性NSCs不具有体内成瘤性。,四、骨髓源神经干细胞的活体示踪,图1 光镜下显示菲立磁（Feridex）标记后的大鼠骨髓源性神经干细胞（培养1周）的典型Prussian Blue染色（可见细胞浆内许多细小的蓝色铁颗粒）,图2 光镜下显示Feridex标记后的大鼠骨髓源性神经干细胞分化为神经元样细胞（）后的Prussian Blue染色（培养1月）,神经干细胞的标记示踪,激光共聚焦显微镜图片显示Feridex标记的大鼠骨髓源性神经干细胞（培养1周）图A Feridex单重标记的骨髓源性神经干细胞（Dragon Green显示）图B Nestin阳性的骨髓源性